[發明專利]一種建立水稻懸浮細胞系的方法及其制備工藝

在審

• 申請號: 201810651748.6
• 申請日: 2018-06-22
• 公開（公告）號: CN108782248A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 龍起樟;萬建林;黃永蘭;唐秀英;王會民;蘆明
• 申請（專利權）人: 江西省超級水稻研究發展中心
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 蘇州中合知識產權代理事務所(普通合伙) 32266
• 代理人: 龍濤

本發明公開了一種建立水稻懸浮細胞系的方法，包括以下步驟：(1)接種用胚性愈傷組織的獲得；(2)將獲得的水稻胚性愈傷組織接種于培養基中，在搖床中振蕩培養；(3)將培養物中的大顆粒愈傷篩除，收集懸浮液，離心，收集沉淀物；(4)添加新鮮培養基，將收集的沉淀物懸浮培養，繼代培養多次后，直至培養基底部小顆粒細胞團大量產生，同時培養液變得較澄清；(5)吸取培養液中的小顆粒進行繼代培養，添加培養基，繼代2次后，轉入不同培養基中繼代，吸取其中小顆粒繼代培養數天，即獲得水稻懸浮細胞系。本發明提供了一種建立水稻懸浮細胞系的方法，可以縮短懸浮細胞培養進程，提高懸浮細胞系的胚性和減少無性系變異。

技術領域

本發明屬于水稻組織細胞培養技術領域，具體涉及一種建立水稻懸浮細胞系的方法。

背景技術

懸浮細胞培養是一種重要的植物生物技術，通過懸浮培養獲得的懸浮細胞系是植物生理生化研究、原生質體分離和生物工程的重要材料。

在水稻中，一般胚性懸浮細胞系的建立要經歷如下步驟：

首先是愈傷組織的準備，要求用于接種的愈傷組織要結合松散、顆粒較小且質地較硬，具有再生性(胚性)；

第二步是初步懸浮培養，接種后經過1個月左右懸浮培養獲得一定量的小顆粒愈傷，繼代時一般要用新鮮培養液置換一部分舊培養液，除了去除褐化愈傷組織外，一般不需要進行篩選，只在培養最后出現較多小顆粒愈傷時對其進行挑選；

第三步是懸浮愈傷的篩選馴化，由于初期培養挑選出來的小顆粒愈傷在繼代時總是傾向于形成較大顆粒，需要在繼代時持續選擇小顆粒，此過程可持續長達7個月；

最后一步是建成懸浮細胞系的維持培養，在獲得分散性良好的懸浮細胞系后，在繼代過程中需要不時去除大顆粒細胞團，維持細胞系的分散性不變。

在后續過程需要植株再生的懸浮細胞培養試驗中，懸浮細胞系本身的胚性以及從其衍生的再生植株的遺傳穩定性對于多數研究而言都比較重要。一般而論，懸浮細胞系經歷的培養時間越長，胚性越低，衍生的再生植株出現無性系變異特別是不育的概率也越大，因此縮短懸浮培養時間對于提高懸浮細胞系的胚性和減少無性系變異至關重要。而在水稻中，通過現有方法構建懸浮細胞系因品種及方法不同一般需要6-8個月，最少也需要4-5個月，如此長的過程往往導致獲得的懸浮細胞系再生性不高，而且無性系變異特別是不育性狀出現的概率也較大。基于此，在水稻懸浮細胞培養中應尋找縮短懸浮培養進程的方法，從而提高懸浮細胞系的胚性和減少無性系變異。

向太和等人發現懸浮培養初期培養基變得比較渾濁的品種容易建成懸浮細胞系，稍微渾濁的品種較難建成懸浮細胞系，而完全澄清的品種無法建成懸浮細胞系，通過鏡檢發現，培養基變得渾濁是由于從愈傷組織上脫落下大量的細胞所致，因此這些研究者認為懸浮培養初期培養液是否渾濁是懸浮細胞系能否成功建成的重要標志[向太和,楊劍波,吳家道.安徽農業科學,1996,24(1):1-8]。

發明內容

本發明針對水稻現有懸浮細胞培養程序歷時較長的問題，提供了一種建立水稻懸浮細胞系的方法，可以縮短懸浮細胞培養進程，從而提高懸浮細胞系的胚性和減少無性系變異。本發明受啟示于背景技術中向太和等人的研究發現，從愈傷組織上脫落的細胞(或小細胞團)最終發育成了我們所需要的小顆粒懸浮細胞團。因此，本申請的發明人通過初期培養時收集脫落細胞進行繼代培養從而獲得小顆粒細胞團。試驗證明，此種操作的確能獲得小顆粒細胞團而且還可以加速懸浮細胞系的建立進程。

本發明公開了一種建立水稻懸浮細胞系的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)接種用胚性愈傷組織的獲得；

(2)將獲得的水稻胚性愈傷組織接種于培養基中，在搖床中振蕩培養；

(3)將培養物中的大顆粒愈傷篩除，收集懸浮液，離心，收集沉淀物；