[發明專利]一種建立水稻懸浮細胞系的方法及其制備工藝在審
| 申請號： | 201810651748.6 | 申請日： | 2018-06-22 |
| 公開（公告）號： | CN108782248A | 公開（公告）日： | 2018-11-13 |
| 發明（設計）人： | 龍起樟;萬建林;黃永蘭;唐秀英;王會民;蘆明 | 申請（專利權）人： | 江西省超級水稻研究發展中心 |
| 主分類號： | A01H4/00 | 分類號： | A01H4/00 |
| 代理公司： | 蘇州中合知識產權代理事務所(普通合伙) 32266 | 代理人： | 龍濤 |
| 地址： | 330200 江西*** | 國省代碼： | 江西;36 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 水稻懸浮細胞系 培養基 繼代培養 小顆粒 培養液 接種 水稻胚性愈傷組織 胚性愈傷組織 懸浮細胞培養 無性系變異 新鮮培養基 懸浮細胞系 懸浮培養 振蕩培養 制備工藝 大顆粒 培養物 細胞團 懸浮液 繼代 胚性 搖床 愈傷 中繼 澄清 轉入 進程 | ||
1.一種建立水稻懸浮細胞系的方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)接種用胚性愈傷組織的獲得；
(2)將獲得的水稻胚性愈傷組織接種于培養基中，在搖床中振蕩培養；
(3)將培養物中的大顆粒愈傷篩除，收集懸浮液，離心，收集沉淀物；
(4)添加新鮮培養基，將收集的沉淀物懸浮培養，懸浮培養過程中間隔不斷添加新鮮培養基，繼代培養多次后，直至培養基底部小顆粒細胞團大量產生，同時培養液變得較澄清；
(5)吸取培養液中的小顆粒進行繼代培養，添加培養基，繼續懸浮培養，繼代2次后，轉入不同培養基中繼代，吸取其中小顆粒繼代培養數次，即獲得水稻懸浮細胞系。
2.根據權利要求1所述的一種建立水稻懸浮細胞系的方法，其特征在于，所述步驟(1)中以Kasalath成熟種子為外植體進行愈傷組織誘導。
3.根據權利要求1所述的一種建立水稻懸浮細胞系的方法，其特征在于，所述步驟(2)中具體操作為：將3-5g水稻胚性愈傷組織接種于30ml培養基中，25-30℃條件下，以80-110轉每分鐘的轉速在搖床中振蕩培養。
4.根據權利要求1所述的一種建立水稻懸浮細胞系的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的培養基為NBL液體培養基。
5.根據權利要求1所述的一種建立水稻懸浮細胞系的方法，其特征在于，所述步驟(3)中的培養物在懸浮培養后培養液變得渾濁時，過40目細胞篩篩除大顆粒愈傷，收集懸浮液，離心5分鐘，收集沉淀物。
6.根據權利要求1所述的一種建立水稻懸浮細胞系的方法，其特征在于，所述步驟(4)中具體操作包括：
(41)保留部分舊培養基，添加相同成分新鮮培養基，將步驟(3)中收集的沉淀物懸浮，懸浮培養條件和溫度與步驟(2)相同，繼代培養4次后，當培養液底部出現較多愈傷時，進行下一步操作；
(42)無需離心直接移除部分舊培養液，加入等體積新鮮培養液，培養條件不變，繼續懸浮培養，相同方法繼代2次，直至培養基底部小顆粒細胞團(直徑1mm以下)大量產生，同時培養液變得較澄清。
7.根據權利要求6所述的一種建立水稻懸浮細胞系的方法，其特征在于，所述步驟(41)中繼代時需要1000rpm離心5min收集懸浮物，并保留舊培養基10ml，添加相同成分新鮮培養基20ml。
8.根據權利要求6所述的一種建立水稻懸浮細胞系的方法，其特征在于，所述步驟(42)中移除20ml舊培養基，加入等體積相同成分新鮮培養基。
9.根據權利要求1所述的一種建立水稻懸浮細胞系的方法，其特征在于，所述步驟(5)中用巴氏吸管吸取其中小顆粒(直徑1mm以下)進行繼代培養。
10.根據權利要求1所述的一種建立水稻懸浮細胞系的方法，其特征在于，所述步驟(5)中按照舊培養基：新培養基比例為1：2添加新鮮培養基，每次吸取其中小顆粒繼代(直徑1mm以下)，在繼代培養40天左右，多數細胞團直徑在0.5mm以下時即獲得水稻懸浮細胞系。
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