[發明專利]微肝組織培養模型、其構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201810651503.3
• 申請日: 2018-06-22
• 公開（公告）號: CN108753687B
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 王韞芳;王振軍;胡健;柳娟;李瑞紅;王勇
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/18
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

1.微肝組織培養模型，是將肝細胞、肝樣細胞和肝相關細胞中的一種或多種，與簡稱為LBS的肝臟生物基質支架的粉末在常規條件下混合培養得到的肝細胞球狀聚集體，即微肝組織培養模型；

所述混合培養為將所述肝細胞、肝樣細胞和肝相關細胞中的一種或多種制成的細胞懸液接種至用細胞常規培養基稀釋所述肝臟生物基質支架粉末制成的LBS溶液中進行混合培養；所述肝細胞球狀聚集體為細胞粘附LBS粉末聚集成的球狀體；

所述的微肝組織培養模型的構建方法包括以下步驟：

1)對細胞進行常規消化處理，制成單細胞懸液；所述細胞為肝細胞、肝樣細胞和肝相關細胞中的一種或多種；

2)用細胞常規培養基將去細胞的肝臟生物基質支架LBS的粉末稀釋為LBS溶液，向細胞板中每孔加入LBS溶液；

3)將細胞懸液接種至細胞板中與LBS溶液混合，將細胞板常規培養，取培養7-28天得到的細胞球狀聚集體作為微肝組織培養模型；

所述肝臟生物基質支架LBS用以下方法獲得：將取自SD大鼠血液流盡后的肝臟，灌注37℃預熱的含30-100ng/mL磷脂酶A2的濃度單位以g/100mL計的1％脫氧膽酸鈉SDC溶液，灌至肝臟幾乎透明后用4℃放置的雙蒸水灌注大鼠肝臟，洗盡肝臟中殘留的SDC，得到去細胞的肝臟生物支架LBS；

所述肝臟生物基質支架LBS粉末用以下方法獲得：將剪碎的LBS凍干脫水后用PBS配成LBS濃度為5W/V％-30W/V％的LBS溶液，液氮環境下在打粉機中經多個循環打粉得到微納級別的細粉；

所述肝臟生物基質支架LBS中總蛋白濃度不低于0.5μg/μL。

2.根據權利要求1所述的微肝組織培養模型，其特征在于：所述肝細胞為普通二維培養的肝細胞或原代分離的肝細胞；所述肝樣細胞為干細胞來源的肝樣細胞或自體來源的iPSC誘導的肝樣細胞；所述肝相關細胞包括血管內皮細胞、免疫細胞、肝星狀細胞。

3.根據權利要求2所述的微肝組織培養模型，其特征在于：所述肝細胞為HepaRG細胞、HepG2細胞；所述肝樣細胞為自體來源的iPSC誘導的肝樣細胞；所述血管內皮細胞為HUVEC細胞，所述免疫細胞包括kuffer細胞。

4.根據權利要求1所述的微肝組織培養模型，其特征在于：所述肝臟生物基質支架為從肝臟中脫去細胞但保留簡稱ECM成分的肝臟細胞外基質的生物材料，即去細胞的肝臟，其保留了原始肝臟器官的總體外觀和尺寸，顏色幾乎透明，含有大部分肝特異性ECM成分、基質結合細胞因子和生長因子。

5.權利要求1至4任一項所述的微肝組織培養模型的構建方法，包括以下步驟：

1)對細胞進行常規消化處理，制成單細胞懸液；所述細胞為肝細胞、肝樣細胞和肝相關細胞中的一種或多種；

2)用細胞常規培養基將去細胞的所述肝臟生物基質支架LBS的粉末稀釋為LBS溶液，向細胞板中每孔加入LBS溶液；

3)將細胞懸液接種至細胞板中與LBS溶液混合，將細胞板常規培養，取培養7-28天得到的細胞球狀聚集體作為微肝組織培養模型；

所述肝臟生物基質支架LBS用以下方法獲得：將取自SD大鼠血液流盡后的肝臟，灌注37℃預熱的含30-100ng/mL磷脂酶A2的濃度單位以g/100mL計的1％脫氧膽酸鈉SDC溶液，灌至肝臟幾乎透明后用4℃放置的雙蒸水灌注大鼠肝臟，洗盡肝臟中殘留的SDC，得到去細胞的肝臟生物支架LBS；

所述肝臟生物基質支架LBS粉末用以下方法獲得：將剪碎的LBS凍干脫水后用PBS配成LBS濃度為5W/V％-30W/V％的LBS溶液，液氮環境下在打粉機中經多個循環打粉得到微納級別的細粉；

所述肝臟生物基質支架LBS中總蛋白濃度不低于0.5μg/μL。