[發(fā)明專利]微肝組織培養(yǎng)模型、其構(gòu)建方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810651503.3
• 申請(qǐng)日: 2018-06-22
• 公開（公告）號(hào): CN108753687B
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王韞芳;王振軍;胡健;柳娟;李瑞紅;王勇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12Q1/18
• 代理公司: 北京尚誠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

1.微肝組織培養(yǎng)模型，是將肝細(xì)胞、肝樣細(xì)胞和肝相關(guān)細(xì)胞中的一種或多種，與簡稱為LBS的肝臟生物基質(zhì)支架的粉末在常規(guī)條件下混合培養(yǎng)得到的肝細(xì)胞球狀聚集體，即微肝組織培養(yǎng)模型；

所述混合培養(yǎng)為將所述肝細(xì)胞、肝樣細(xì)胞和肝相關(guān)細(xì)胞中的一種或多種制成的細(xì)胞懸液接種至用細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)基稀釋所述肝臟生物基質(zhì)支架粉末制成的LBS溶液中進(jìn)行混合培養(yǎng)；所述肝細(xì)胞球狀聚集體為細(xì)胞粘附LBS粉末聚集成的球狀體；

所述的微肝組織培養(yǎng)模型的構(gòu)建方法包括以下步驟：

1)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)消化處理，制成單細(xì)胞懸液；所述細(xì)胞為肝細(xì)胞、肝樣細(xì)胞和肝相關(guān)細(xì)胞中的一種或多種；

2)用細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)基將去細(xì)胞的肝臟生物基質(zhì)支架LBS的粉末稀釋為LBS溶液，向細(xì)胞板中每孔加入LBS溶液；

3)將細(xì)胞懸液接種至細(xì)胞板中與LBS溶液混合，將細(xì)胞板常規(guī)培養(yǎng)，取培養(yǎng)7-28天得到的細(xì)胞球狀聚集體作為微肝組織培養(yǎng)模型；

所述肝臟生物基質(zhì)支架LBS用以下方法獲得：將取自SD大鼠血液流盡后的肝臟，灌注37℃預(yù)熱的含30-100ng/mL磷脂酶A2的濃度單位以g/100mL計(jì)的1％脫氧膽酸鈉SDC溶液，灌至肝臟幾乎透明后用4℃放置的雙蒸水灌注大鼠肝臟，洗盡肝臟中殘留的SDC，得到去細(xì)胞的肝臟生物支架LBS；

所述肝臟生物基質(zhì)支架LBS粉末用以下方法獲得：將剪碎的LBS凍干脫水后用PBS配成LBS濃度為5W/V％-30W/V％的LBS溶液，液氮環(huán)境下在打粉機(jī)中經(jīng)多個(gè)循環(huán)打粉得到微納級(jí)別的細(xì)粉；

所述肝臟生物基質(zhì)支架LBS中總蛋白濃度不低于0.5μg/μL。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微肝組織培養(yǎng)模型，其特征在于：所述肝細(xì)胞為普通二維培養(yǎng)的肝細(xì)胞或原代分離的肝細(xì)胞；所述肝樣細(xì)胞為干細(xì)胞來源的肝樣細(xì)胞或自體來源的iPSC誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞；所述肝相關(guān)細(xì)胞包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微肝組織培養(yǎng)模型，其特征在于：所述肝細(xì)胞為HepaRG細(xì)胞、HepG2細(xì)胞；所述肝樣細(xì)胞為自體來源的iPSC誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞；所述血管內(nèi)皮細(xì)胞為HUVEC細(xì)胞，所述免疫細(xì)胞包括kuffer細(xì)胞。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微肝組織培養(yǎng)模型，其特征在于：所述肝臟生物基質(zhì)支架為從肝臟中脫去細(xì)胞但保留簡稱ECM成分的肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的生物材料，即去細(xì)胞的肝臟，其保留了原始肝臟器官的總體外觀和尺寸，顏色幾乎透明，含有大部分肝特異性ECM成分、基質(zhì)結(jié)合細(xì)胞因子和生長因子。

5.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的微肝組織培養(yǎng)模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)消化處理，制成單細(xì)胞懸液；所述細(xì)胞為肝細(xì)胞、肝樣細(xì)胞和肝相關(guān)細(xì)胞中的一種或多種；

2)用細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)基將去細(xì)胞的所述肝臟生物基質(zhì)支架LBS的粉末稀釋為LBS溶液，向細(xì)胞板中每孔加入LBS溶液；

3)將細(xì)胞懸液接種至細(xì)胞板中與LBS溶液混合，將細(xì)胞板常規(guī)培養(yǎng)，取培養(yǎng)7-28天得到的細(xì)胞球狀聚集體作為微肝組織培養(yǎng)模型；

所述肝臟生物基質(zhì)支架LBS用以下方法獲得：將取自SD大鼠血液流盡后的肝臟，灌注37℃預(yù)熱的含30-100ng/mL磷脂酶A2的濃度單位以g/100mL計(jì)的1％脫氧膽酸鈉SDC溶液，灌至肝臟幾乎透明后用4℃放置的雙蒸水灌注大鼠肝臟，洗盡肝臟中殘留的SDC，得到去細(xì)胞的肝臟生物支架LBS；

所述肝臟生物基質(zhì)支架LBS粉末用以下方法獲得：將剪碎的LBS凍干脫水后用PBS配成LBS濃度為5W/V％-30W/V％的LBS溶液，液氮環(huán)境下在打粉機(jī)中經(jīng)多個(gè)循環(huán)打粉得到微納級(jí)別的細(xì)粉；

所述肝臟生物基質(zhì)支架LBS中總蛋白濃度不低于0.5μg/μL。