[發(fā)明專利]微肝組織培養(yǎng)模型、其構(gòu)建方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810651503.3
• 申請(qǐng)日: 2018-06-22
• 公開（公告）號(hào): CN108753687B
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王韞芳;王振軍;胡健;柳娟;李瑞紅;王勇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12Q1/18
• 代理公司: 北京尚誠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

本發(fā)明公開了一種微肝組織模型、其構(gòu)建方法及其應(yīng)用。該微肝組織模型是將肝細(xì)胞、肝樣細(xì)胞、肝相關(guān)細(xì)胞中的一種或多種，與去細(xì)胞的肝臟生物基質(zhì)支架LBS或LBS粉末在常規(guī)條件下混合培養(yǎng)得到的肝細(xì)胞球狀聚集體。利用該模型，能夠重現(xiàn)復(fù)雜的生物和生物化學(xué)相關(guān)微環(huán)境，為肝細(xì)胞或肝樣細(xì)胞提供更接近于體內(nèi)細(xì)胞的微環(huán)境，從而提高了肝細(xì)胞或肝樣細(xì)胞對(duì)肝毒性化合物物的敏感度，可在藥物、中草藥、化合物、化妝品等多種物質(zhì)肝毒性安全性評(píng)測(cè)中應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及組織化培養(yǎng)模型及其構(gòu)建方法，特別涉及一種肝毒性藥物安全性評(píng)測(cè)用三維微肝組織培養(yǎng)模型及其構(gòu)建方法與其在藥物、中草藥、化妝品等相關(guān)物質(zhì)的肝毒性評(píng)測(cè)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

肝臟在藥物(或外源性毒物)的代謝和處置中起著十分重要的作用，大多數(shù)藥物和毒物在肝內(nèi)經(jīng)生物轉(zhuǎn)化作用而排出體外。藥物誘導(dǎo)的肝損傷(Drug-Induced LiverInjury，DILI)是導(dǎo)致肝功能障礙的最常見原因，也常導(dǎo)致藥物研發(fā)失敗，以及藥物上市后被撤回或使用限制。此外，化妝品中重金屬超標(biāo)，新裝修的房子甲醛超標(biāo)，使用有毒的干洗劑四氯乙烯干洗衣物等都可能導(dǎo)致中毒性肝臟損傷。

肝細(xì)胞是具有高度極性化的細(xì)胞，其極性是維持肝臟獨(dú)特生理功能的基礎(chǔ)，而傳統(tǒng)二維培養(yǎng)的細(xì)胞呈平面生長，細(xì)胞因在培養(yǎng)條件下缺少細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的接觸而喪失極性，因而喪失肝細(xì)胞功能。此外，藥物代謝酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體等與藥物代謝相關(guān)的酶表達(dá)量及活性隨培養(yǎng)時(shí)間延長而急劇降低，這些極大限制了二維培養(yǎng)的肝系細(xì)胞在藥物安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用；而用于體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型的價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)周期長，還涉及動(dòng)物福利問題。并且對(duì)于化妝品的毒性檢測(cè)，使用動(dòng)物模型更是阻礙重重，在2013年，歐盟就禁止銷售經(jīng)過動(dòng)物測(cè)試的化妝品。更為重要的是，由于藥物代謝酶具有種屬特異性，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果常無法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)臨床人體反應(yīng)。因此，開發(fā)建立一種高效、精確、可重復(fù)且廉價(jià)的體外培養(yǎng)體系用于藥物、化妝品等安全性尤其是肝毒性實(shí)驗(yàn)和研究，具有重要的理論和應(yīng)用意義。

隨著組織工程學(xué)科的發(fā)展，科學(xué)家們提出并逐漸完善了組織化培養(yǎng)技術(shù)(或稱三維培養(yǎng))，這種培養(yǎng)方法獲得的細(xì)胞在基因表達(dá)、基質(zhì)分泌及細(xì)胞功能活動(dòng)等方面與單層培養(yǎng)均有明顯差異，與體內(nèi)細(xì)胞生長情況更為相似，而且三維細(xì)胞培養(yǎng)既能保留體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，又能體現(xiàn)為細(xì)胞生長提供物質(zhì)基礎(chǔ)，能夠?qū)⒔M織化細(xì)胞培養(yǎng)體系與組織器官及整體研究聯(lián)系起來。

建立良好的微組織化培養(yǎng)模型，包含三個(gè)重要因素，種子細(xì)胞、支架材料與微環(huán)境。具有良好的生物相容性支架材料是有效模擬細(xì)胞外基質(zhì)、提供細(xì)胞體外構(gòu)建三維組織模型的關(guān)鍵因素。人們不斷探索使用不同的生物材料做支架，如納米纖維支架、三維聚苯乙烯薄膜、多孔支架、膠原水凝膠支架、Matrigel等。

“Development of complex-shaped liver multicellular spheroids as ahuman-based model for nanoparticle toxicity assessment in vitro”(MonikaDubiak-Szepietowska,2016)采用三種不同的水凝膠制備肝臟多細(xì)胞球體：即無生長因子和酚紅的基質(zhì)膠(Corning，荷蘭)、豬皮膚來源的(Sigma)A型明膠和I型膠原蛋白(Sigma)的A型明膠。用DMEM制備1mg/mL的基質(zhì)膠儲(chǔ)備液，在接種細(xì)胞前以1：1的比例用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋。將DMEM中10％明膠溶液(v/v)在37℃下孵育30分鐘后用0.22μm孔徑的注射器過濾器過濾，然后用1％(v/v)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(100u/g，Ajinomoto)進(jìn)行交聯(lián)。通過混合DMEM和I型膠原溶液(10mg/ml，在0.1％乙酸中)獲得膠原凝膠，并用1M NaOH(Sigma)將pH調(diào)節(jié)至7.4。將HepG2細(xì)胞與上述水凝膠混合，并在37℃下在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此模型中使用的水凝膠支架材料成分均較為單一，難以模擬肝細(xì)胞在體內(nèi)復(fù)雜的生長環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于化合物肝毒性評(píng)測(cè)的微肝組織模型。