[發明專利]一種肝臟干細胞制備和提取方法

在審

• 申請號: 201810650659.X
• 申請日: 2018-06-22
• 公開（公告）號: CN108823146A
• 公開（公告）日: 2018-11-16
• 發明（設計）人: 安徽
• 申請（專利權）人: 安徽
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 深圳市神州聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 44324
• 代理人: 鄧揚

本發明公開了一種肝臟干細胞制備和提取方法，包括以下步驟，清洗消毒，將肝臟組織用凈水沖洗表層，并使用酒精棉擦拭，然后浸泡在生理鹽水中，浸泡時間為3min；酶解，取出肝臟組織后使用PBS緩沖液沖洗干凈，將肝臟組織切成小塊放入蛋白酶溶液中，溶解時間為6～24h，用過濾網過濾酶解液；分離；篩選，將分離后的酶解液接種到基礎培養基中直至出現細胞簇，觀察細胞外形確定肝臟干細胞，并篩選出肝臟干細胞；保存，本發明涉及生物工程技術領域。該肝臟干細胞制備和提取方法，使干細胞的篩選過程更加簡單，降低了干細胞的篩選成本，同時有效的去除了干細胞組織液中可能出現的雜質，提高了提取后的干細胞的研究和使用價值。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，具體為一種肝臟干細胞制備和提取方法。

背景技術

干細胞是一類具有自我復制能力的多潛能細胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞，根據干細胞所處的發育階段分為胚胎干細胞和成體干細胞，根據干細胞的發育潛能分為三類:全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞(專能干細胞)，干細胞是一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫學界稱為“萬用細胞”。但是現有的干細胞提取方法篩選干細胞過程復雜，篩選成本較高，干細胞提取過程中容易殘留雜質，影響干細胞的研究和使用性能。

發明內容

（一）解決的技術問題

針對現有技術的不足，本發明提供了一種肝臟干細胞制備和提取方法，解決了現有的干細胞提取方法篩選干細胞過程復雜，篩選成本較高，干細胞提取過程中容易殘留雜質，影響干細胞的研究和使用性能的問題。

（二）技術方案

為實現以上目的，本發明通過以下技術方案予以實現：一種肝臟干細胞制備和提取方法，包括以下步驟，

（1）清洗消毒，將肝臟組織用凈水沖洗表層，并使用酒精棉擦拭，然后浸泡在生理鹽水中，浸泡時間為3min；

（2）酶解，取出肝臟組織后使用PBS緩沖液沖洗干凈，將肝臟組織切成小塊放入蛋白酶溶液中，溶解時間為6～24h，用過濾網過濾酶解液；

（3）分離，倒入5倍蒸餾水稀釋酶解液，用干凈玻璃棒攪拌混合均勻，倒入差速離心機中；

（4）篩選，將分離后的酶解液接種到基礎培養基中直至出現細胞簇，觀察細胞外形確定肝臟干細胞，并篩選出肝臟干細胞；

（5）保存，將肝臟干細胞保存在低溫室內，溫度應為4℃。

優選的，所述蛋白酶溶液為胰蛋白酶和ETDA，所述胰蛋白酶和ETDA的濃度分別為1g/L和0.5g/L。

優選的，所述胰蛋白酶和ETDA的體積比為1:3。

優選的，所述基礎培養基為干細胞無血清基礎培養基。

優選的，所述肝臟組織酶解液培養過程中應保持遮光環境。

優選的，所述干細胞無血清基礎培養基中應加入干細胞無血清營養添加物，并且干細胞無血清基礎培養基與干細胞無血清營養添加物的體積比為10:1。

優選的，所述肝臟組織酶解液培養一段時間后應接種到新的基礎培養基中繼續培養。

優選的，所述肝臟組織酶解液在基礎培養基中的培養時間應為24～48h。

優選的，所述酶解液在差速離心機中的離心時間應為10min，離心力應為200g。

優選的，所述酶解液離心處理后應去除上清液。

（三）有益效果

本發明提供了一種肝臟干細胞制備和提取方法。具備以下有益效果：