[發明專利]基于納米抗體和抗原模擬肽的黃曲霉毒素磁珠-酶聯免疫吸附檢測方法

在審

• 申請號: 201810650332.2
• 申請日: 2018-06-22
• 公開（公告）號: CN108794580A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 趙鳳春;楊正友;申強;朱常香
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;G01N33/535;G01N33/543
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 王志坤

本發明涉及檢測技術領域，具體涉及一種基于納米抗體和抗原模擬肽的黃曲霉毒素磁珠?酶聯免疫吸附檢測方法。本發明黃曲霉毒素抗原模擬肽，以黃曲霉毒素納米抗體Nb28制備的免疫為靶標，通過噬菌體展示技術篩選得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。本發明首次將納米抗體Nb28與之相應的抗原模擬肽同時用于黃曲霉毒素免疫磁珠?ELISA檢測，可實現對黃曲霉毒素的快速檢測。本發中使用的基因工程抗體及抗原模擬肽的基因及氨基酸序列都可確定，易于生產、推廣和應用。

技術領域

本發明涉及檢測技術領域，具體涉及一種基于納米抗體和抗原模擬肽的黃曲霉毒素磁珠-酶聯免疫吸附檢測方法。

背景技術

黃曲霉毒素主要由黃曲霉(Aspergillus flavus)與寄生曲霉(Aspergillusparaciticus)等產生的有毒次生代謝產物，目前共分離出20多種，包括AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂、AFB_2a、AFGM、AFH₁、AFM₁、AFM₂、AFP₁、AFQ和毒醇。其中AFB₁的毒害作用最大，1993年，世界衛生組織(WHO)將AFB₁及黃曲霉毒素混合物列為Ι類致癌物。世界范圍內黃曲霉毒素的污染極為廣泛，尤其在濕熱環境中污染最為嚴重，比如我國長江流域因其氣候特點成為黃曲霉毒素的高污染地區。鑒于真菌毒素具有污染范圍廣、毒性強等特點，建立能夠滿足快速、方便、準確、靈敏的真菌毒素檢測技術極為必要。

目前，黃曲霉毒素的檢測方法主要有儀器分析法(如：高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)、液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)等)和免疫分析法(如：酶聯免疫吸附法(ELISA)、免疫膠體金技術(ICGT)、熒光免疫檢測(IFA)等)。儀器分析法雖然具有靈敏度高、準確性好等優點，但是其往往需要繁瑣的樣品處理過程且需要昂貴的儀器，無法滿足大批量樣品的快速篩查；免疫分析法是一種快速、靈敏、經濟、高通量的分析方法，適用于大量樣品快速分析的需要。

傳統的黃曲霉毒素ELISA檢測法大多是基于單克隆抗體與化學合成抗原配對建立的，這類方法存在著抗體制備難度大，抗原合成過程具有毒性等缺點。近年來研究者們針對真菌毒素的免疫檢測方法中抗體及抗原做了如下改進：第一、使用基因工程抗體代替單克隆抗體與化學合成抗原的配對使用，第二、使用抗原模擬肽代替化學合成抗原與單克隆抗體的配對使用。但是，同時對免疫分析中使用的抗體和抗原進行改進，即同時利用基因工程抗體和抗原模擬肽配對建立真菌毒素免疫檢測方法的研究未見報道。

發明內容

本發明的主要目的是，提供一種基于納米抗體和抗原模擬肽的黃曲霉毒素磁珠-酶聯免疫吸附檢測方法。本發明將黃曲霉毒素納米抗體Nb28制備成免疫磁珠，并利用噬菌體展示技術篩選得到Nb28對應的抗原模擬肽；本發明首次將基因工程抗體和抗原模擬肽配對，建立了黃曲霉毒素直接競爭磁珠-ELISA，實現了對黃曲霉毒素的準確、快速檢測。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

本發明目的之一，提供一種黃曲霉毒素抗原模擬肽，所述抗原模擬肽以Nb28免疫磁珠為靶標，通過噬菌體展示技術篩選得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。與真菌毒素的化學合成抗原相比，抗原模擬肽易于獲得且無毒，有利于推動綠色免疫分析技術的發展。

本發明目的之二，提供一種基于納米抗體和抗原模擬肽的黃曲霉毒素磁珠-酶聯免疫吸附的建立方法，包括以下步驟：

(1)納米抗體Nb28免疫磁珠的制備；