[發明專利]基于納米抗體和抗原模擬肽的黃曲霉毒素磁珠-酶聯免疫吸附檢測方法

在審

• 申請號: 201810650332.2
• 申請日: 2018-06-22
• 公開（公告）號: CN108794580A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 趙鳳春;楊正友;申強;朱常香
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;G01N33/535;G01N33/543
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 王志坤

1.一種黃曲霉毒素抗原模擬肽，其對應于黃曲霉毒素納米抗體Nb28，通過噬菌體展示技術篩選得到，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQID NO.6所示。

2.根據權利要求1所述黃曲霉毒素抗原模擬肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

3.一種基于納米抗體和抗原模擬肽的黃曲霉毒素磁珠-酶聯免疫吸附的建立方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)納米抗體Nb28免疫磁珠的制備；

(2)酶標抗原模擬肽的制備：以權利要求1所述黃曲霉毒素抗原模擬肽為模板進行多肽合成，通過雙功能交聯劑Sulfo-SMCC將抗原模擬肽與辣根過氧化物酶偶聯，即得；

(3)黃曲霉毒素直接競爭磁珠-ELISA的建立

將步驟(1)制備得到的納米抗體Nb28免疫磁珠與步驟(2)制備得到的酶標抗原模擬肽組合，建立黃曲霉毒素直接競爭磁珠-ELISA。

4.根據權利要求3所述建立方法，其特征在于，步驟(1)納米抗體Nb28免疫磁珠的制備方法為：將合成的Nb28基因插入到pET-BAD質粒中構建表達載體pET-Nb28-BAD，表達載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)制備Nb28-BAD表達菌株；將表達菌株在20℃誘導表達過夜，誘導后將菌體收集破碎后離心，將上清液轉移至新離心管，加入生物素化緩沖液和生物素連接酶，室溫反應；生物素化反應后通過Ni-IDA resin純化獲得生物素化Nb28-BAD融合蛋白；將純化的生物素化Nb28-BAD融合蛋白與鏈霉親和素磁珠混合并室溫孵育，磁分離并使用PBS洗滌后，即得。

5.根據權利要求3所述建立方法，其特征在于，步驟(2)具體方法為以SEQ ID NO.4所示氨基酸序列為模板，并添加連接臂，合成得到ME17-17AA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

6.根據權利要求3所述建立方法，其特征在于，步驟(2)酶標抗原模擬肽稀釋液為含8％脫脂奶粉的PBS。

7.根據權利要求3所述建立方法，其特征在于，步驟(3)納米抗體Nb28免疫磁珠酶標抗原模擬肽孵育時間為20min。

8.根據權利要求3所述建立方法，其特征在于，步驟(3)黃曲霉毒素直接競爭磁珠-ELISA的工作條件為：離子濃度為10-150mM，甲醇濃度為5-35％，pH值為7.0-9.0。

9.根據權利要求8所述建立方法，其特征在于，步驟(3)黃曲霉毒素直接競爭磁珠-ELISA的工作條件為：離子濃度為50mM，甲醇濃度為17.5％，pH值為7.4。

10.權利要求1所述黃曲霉毒素抗原模擬肽和/或權利要求3-9任一所述建立方法得到的黃曲霉毒素直接競爭磁珠-ELISA在檢測黃曲霉毒素中的應用。