[發明專利]朱欒外果皮DNA在朱欒種質資源鑒定分析中的應用

在審

• 申請號: 201810648110.7
• 申請日: 2018-06-19
• 公開（公告）號: CN109576351A
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發明（設計）人: 李明娟;黃嬛;蔣小紅;高廣春;周超瑞
• 申請（專利權）人: 嘉興學院
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6806
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧

本發明涉及生物物種的檢測領域，具體地，涉及朱欒外果皮基因組DNA在朱欒種質資源鑒定分析中的應用及分析方法。本發明通過從朱欒外果皮組織中提取DNA，在對提取的DNA進行PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，進而根據瓊脂糖凝膠電泳中是否出現特異性陽性條帶來鑒定其是否屬于朱欒。本發明通過對比朱欒果實不同部位提取的基因組DNA的濃度、純度及PCR擴增特征，發現朱欒外果皮基因組DNA可以特異性的將其與近源物種進行區分，而從中果皮、囊、內果皮提取的DNA并不能將其與近源物種進行區分，這一發現對朱欒物種鑒定具有指導意義，本發明所述的鑒定方法具有快速、簡便、經濟適用的特點。

技術領域

本發明涉及生物物種的檢測領域，具體地，涉及朱欒外果皮基因組DNA在朱欒種質資源鑒定分析中的應用及分析方法。

背景技術

枳殼作為一種常用中藥,是蕓香科植物酸橙及其栽培變種黃皮酸橙、代代花、朱欒和塘橙的干燥未成熟果實，臨床主要用于治療胸悶脹痛、食積不化、痰飲、胃下垂、脫肛、子宮脫垂等癥狀，具有重要的藥用價值。由于枳殼品種繁多、種植區域廣泛，來源復雜，兼之以次充好、以假充真，使得同物異名、同名異物現象嚴重，枳殼交易市場混亂，為研究和臨床用藥帶來不便。

朱欒是枳殼的一種主要栽培變種，由于朱欒與其近源種藥材在外觀上比較接近，依靠形態難以進行鑒定。因此，如何有效、快速地鑒定朱欒成為一個亟須解決的問題，通過鑒定朱欒不僅可以將其與近源物種進行區分，為研究朱欒的作用奠定基礎，同時通過鑒定朱欒也可以初步鑒別某一物種是否可以歸屬于枳殼類。

傳統的鑒別方法主要有基源鑒別、性狀鑒別、顯微鑒別和理化鑒別，主要依靠外觀性狀特征進行區別，易受外界因素影響。雖然通過基源、顯微、理化等方法可以從某種角度上較為客觀地鑒別朱欒，但是均存在一定局限性，尤其受生長環境、氣候、加工炮制、取材部位等因素影響。為了保證朱欒臨床用藥的安全有效，尋找一套快速、科學的鑒定檢測技術勢在必行。

DNA分子標記技術在中藥材鑒定中具有廣泛的應用，為中藥材鑒定方法的探索注入了活力，帶來了新的方向。DNA分子標記技術具有微量、快速、準確、特異性強、對樣本要求較低的特點，能夠彌補傳統生藥鑒定方法的不足。但是，DNA分子標技術也存在一些不足：①中藥材的DNA提取困難，中藥材經過炮制處理，雜質含量高，難以提取適合后續PCR反應的優質DNA；②對實驗技術人員要求高；③設備要求高，成本較高，難普及；④重現性不好，鑒別程序復雜；⑤不同部位入藥的藥材難以區分。高質量的基因組DNA是應用DNA分子標記技術的先決條件，能否順利進行后續鑒定取決于提取的基因組DNA的質量，DNA濃度過低或純度過低均會影響分子鑒定的后續操作。

本發明通過對朱欒DNA提取過程進行優化，探討朱欒果實不同取材部位提取的基因組DNA在朱欒種質資源鑒定分析中的應用，這對于枳殼類藥材的物種鑒定是一項有益補充，有利于質監部門進行快速、準確的品種檢驗。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種朱欒種質資源鑒定分析方法。

在一些優選方式中，所述方法利用朱欒外果皮基因組DNA進行PCR擴增，包括如下步驟：

(1)提取待測樣品的外果皮DNA；

(2)合成引物，以提取的DNA為模板進行PCR擴增；

(3)將步驟(2)中得到的產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

本發明還提供一種朱欒DNA在朱欒種質資源鑒定分析中的應用。

在一些優選方式中，所述DNA為朱欒外果皮基因組DNA；

在一些優選方式中，所述外果皮基因組DNA的提取包括如下步驟：

(1)取外果皮組織約50mg，研磨至過120目篩的極細粉，裝入EP管中；