[發(fā)明專利]用于檢測(cè)綠僵菌植物內(nèi)生性的綠色熒光蛋白標(biāo)記基因egfp特異性引物、試劑盒及方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810648106.0
• 申請(qǐng)日: 2018-06-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108913796A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-11-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 農(nóng)向群;蔡霓;王峰;王廣君;曹廣春;涂雄兵;張澤華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京法思騰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11318
• 代理人: 高宇

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及檢測(cè)綠僵菌植物內(nèi)生性的綠色熒光蛋白標(biāo)記基因egfp特異性引物、試劑盒及方法。本發(fā)明合成綠色熒光蛋白基因的特異性引物，培養(yǎng)綠色熒光蛋白標(biāo)記的綠僵菌，再通過(guò)將綠僵菌與植物共培養(yǎng)，驗(yàn)證綠漿菌在植物根中的共生性，驗(yàn)證方法具有靈敏度高、專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)綠僵菌植物內(nèi)生性的綠色熒光蛋白標(biāo)記基因egfp特異性引物、試劑盒及方法。

背景技術(shù)

昆蟲(chóng)病原真菌能夠侵染寄生昆蟲(chóng)，使昆蟲(chóng)罹病死亡，其殺蟲(chóng)功能已被用于植物害蟲(chóng)的防控治理中。近年研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲(chóng)病原真菌除了能夠侵染害蟲(chóng)減少植物蟲(chóng)害以外，還能夠進(jìn)入植物宿存、促進(jìn)植物的發(fā)育生長(zhǎng)。目前證明至少有8屬種殺蟲(chóng)真菌可在植物體內(nèi)定植，包括綠僵菌(Metarhizium anisopliae,M.robertsii)、白僵菌(Beauveria bassiana)、擬青霉(Paecilomyces sp.)、蠟蚧輪枝孢(Lecanicilliumlecanii)、蟲(chóng)草棒束孢(Isariafarinosa)、支頂孢(Acremoniumsp.)、枝孢菌(Cladosporiumsp.)、食線蟲(chóng)真菌(Plectosphaerella cucumerina)，還有抑制植物土傳病害的粉紅粘帚霉(Clonostachysrosea)等。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生的殺蟲(chóng)真菌與植物形成一定的互惠共生關(guān)系，例如綠僵菌提高番茄的株高、根長(zhǎng)和生物量，促進(jìn)柳枝稷和扁豆根生長(zhǎng)發(fā)育，提高大豆的抗鹽特性；白僵菌在小麥植株中定植，促進(jìn)了小麥植株的生長(zhǎng)。這些防真菌自身種群的大量繁殖并不在植物內(nèi)，而是在相應(yīng)的寄主蟲(chóng)體中。它們?cè)谥参镏兴薮娴纳飳W(xué)意義深受關(guān)注，已成為近年研究熱點(diǎn)。

不同于植物病害菌侵入植物后會(huì)大量繁殖的是，殺蟲(chóng)真菌在植物中通常只有少量存在，發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)植物內(nèi)生的殺蟲(chóng)真菌具有較大難度。現(xiàn)有的檢測(cè)植物內(nèi)生菌的主要方法為分離培養(yǎng)法，即用選擇性培養(yǎng)基分離到植物內(nèi)生菌群，再進(jìn)行單菌落培養(yǎng)，通過(guò)鑒別菌落形態(tài)和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的顯微形態(tài)來(lái)鑒定類別。這種方法需要有選擇性好的培養(yǎng)基，僅適用于可在培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的、在植物中存活數(shù)量較大的類群，其檢測(cè)的靈敏度較低，分離過(guò)程中極易遺漏掉存活量較少的如綠僵菌的殺蟲(chóng)真菌。

為了確證殺蟲(chóng)真菌的內(nèi)生性，現(xiàn)有技術(shù)將供試殺蟲(chóng)菌株加上易于檢測(cè)的同位素，然后通過(guò)人工接種植物共培養(yǎng)，檢測(cè)植物中是否存在殺蟲(chóng)真菌的人工標(biāo)記。此法證明了在蟲(chóng)體與植物不接觸的情況下，綠僵菌感染的病蟲(chóng)體上的¹⁵N被轉(zhuǎn)運(yùn)到植株根內(nèi)，證明了綠僵菌是氮元素在昆蟲(chóng)與植株之間傳遞的橋梁。然而，同位素標(biāo)記方法需要特殊的檢測(cè)儀器和防護(hù)環(huán)境，過(guò)程較為繁瑣，并且該實(shí)驗(yàn)沒(méi)有給出綠僵菌菌體進(jìn)入植物或存在于植物內(nèi)的直接證據(jù)，因此不能排除¹⁵N通過(guò)菌體的次級(jí)代謝分泌到土壤中再被植物攝取的可能。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的不能快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確檢測(cè)植物體內(nèi)的綠僵菌的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)綠僵菌植物內(nèi)生性的綠色熒光蛋白標(biāo)記基因egfp特異性的引物，其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)。

本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)綠僵菌植物內(nèi)生性的綠色熒光蛋白標(biāo)記基因egfp特異性的引物。

本發(fā)明的再一目的是提供含有上述引物的試劑盒。

本發(fā)明的再一目的是提供利用上述引物檢測(cè)綠僵菌在植物體內(nèi)內(nèi)生性的方法。

本發(fā)明的再一目的是提供上述引物對(duì)在檢測(cè)綠僵菌在植物的內(nèi)生性方面的應(yīng)用。

本發(fā)明構(gòu)建了綠色熒光蛋白基因egfp標(biāo)記的綠僵菌菌株IPPMaG-58，該菌株的特征是：菌株基因組中插入了含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因egfp的核苷酸片段，長(zhǎng)度1024bp，其中的egfp基因能夠隨菌體生長(zhǎng)過(guò)程在菌絲體和孢子中表達(dá)eGFP蛋白，該蛋白可以通過(guò)一定波長(zhǎng)的光照激發(fā)顯現(xiàn)熒光，即能夠被觀察和拍攝記錄。

綠僵菌菌株IPPMaG-58中插入的綠色熒光蛋白標(biāo)記基因egfp的序列(1204bp)，如SEQ NO ID 1所示：