[發明專利]RAA熒光法檢測裂谷熱病毒的引物探針組及試劑盒

在審

• 申請號: 201810644415.0
• 申請日: 2018-06-21
• 公開（公告）號: CN108624720A
• 公開（公告）日: 2018-10-09
• 發明（設計）人: 鄭偉;吳忠華;麻慧君;黃雷;楊永耀;郭利川;湯賽君;王智宏;應清界
• 申請（專利權）人: 浙江國際旅行衛生保健中心（浙江出入境檢驗檢疫局口岸門診部）;江蘇奇天基因生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

本發明涉及RAA熒光法檢測裂谷熱病毒的引物探針組及試劑盒，屬于分子生物學檢測技術領域。本發明提供的RAA熒光法檢測裂谷熱病毒的引物探針組包括上游引物、下游引物和探針，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探針為在SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第28位堿基修飾熒光報告基團、第29位堿基替換為四氫呋喃殘基和第30位堿基修飾淬滅基團的物質。本發明提供的引物探針組檢測快速、準確、靈敏、操作簡便，特異性達100％，能夠在15min內完成對裂谷熱病毒的檢測。

技術領域

本發明涉及分子生物學檢測技術領域，具體涉及RAA熒光法檢測裂谷熱病毒的引物探針組及試劑盒。

背景技術

裂谷熱(Rift Valley fever，RVF)是由裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus，RVFV)引起的一種人獸共患病，是由節肢動物傳播的發熱性、急性傳染病，主要通過蚊媒傳播，也可通過氣溶膠和接觸傳播，主要宿主是綿羊、山羊和牛，其流行特征是妊娠動物出現出現急促流產，幼小動物的死亡率高，同時伴有人群的發病和死亡。該病流行于非洲和阿拉伯半島地區，流行常伴隨著特大降雨的周期循環，較少發生在半干旱地區，或者較頻繁發生在較大雨量的草原地區，病變特征為肝損傷。WHO已將其列為生物戰劑之一，世界動物衛生組織(OIE)將其列為A類疫病。

裂谷熱病毒歸屬布尼亞病毒科白蛉熱病毒屬，有囊膜，呈球形，直徑為90～100nm，表面有糖蛋白突起，其核酸位于病毒的核衣殼內，為單股負鏈RNA。裂谷熱病毒為一種單一血清型的病毒，具有布尼病毒的典型形態學和理化特性。病毒有囊膜，直徑90～110nm，呈球形，表面有清楚的糖蛋白突起，突起直徑長10mm。病毒核酸位于病毒的核衣殼內，為單股負鏈RNA，RNA可分為L(大)、M(中)、S(小)三個節段。其中的S節段為雙意義的RNA，即具有雙定向編碼功能，編碼N蛋白和另外一種非結構蛋白(Ns)；M節段編碼G1與G2兩種外膜糖蛋白和兩種非結構蛋白QNSm，大小分別為14kD和78kD)，G1和G2糖蛋白都能刺激機體產生抗體，但在體內只有G2能刺激機體產生中和抗體；L節段編碼L蛋白，L蛋白具有病毒轉錄酶的功能。病毒粒子不含基質蛋白。該病毒只有一種血清型，目前還未發現裂谷熱病毒的分離株和實驗室傳代株的特異性抗原差異。此病毒對脂溶劑和熱敏感，56℃40分鐘可滅活。

近年來，由于國際合作的加深，各國間貿易往來頻繁，旅行者數量逐年遞增，這些都增大了裂谷熱傳入我國的可能性。因此，在國境口岸建立該病毒的快速檢驗方法，并應用于口岸裂谷熱病毒的監測工作，對防治該病傳入我國具有重要意義。

目前診斷裂谷熱病毒的方法有病毒分離法、血清學診斷法如血凝抑制試驗、病毒中和試驗以及酶聯免疫吸附法。但是這些方法或是需操作活病毒，或是操作復雜、費時、費力，或是敏感度不夠高，不能在早期得出診斷結果。近年來，發展起來的分子生物學方法如聚合酶鏈式反應(RT-PCR)以及等溫核酸技術中的RT-LAMP法已經建立起來，并且在裂谷熱病毒的檢測上已得到較好的應用，大大縮短了檢測的時間。以RT-PCR技術為代表如多重RT-PCR、RT-巢式PCR以及實時定量RT-PCR以其高度的特異性及敏感性在裂谷熱病毒檢測方面取得了重大的突破。但是這些方法需要使用復雜的儀器和裝備精良的實驗室。等溫核酸技術中的RT-LAMP方法克服了RT-PCR技術需要昂貴的設備儀器等缺點，具有操作簡便，結果判斷簡單等優點。但是，RT-LAMP技術要求多對引物且對靶基因的要求較高，假陽性率也比較高。

發明內容

本發明的目的在于提供RAA熒光法檢測裂谷熱病毒的引物探針組及試劑盒。本發明提供的引物探針組具有特異性強、靈敏度高、重復性好的特點，使用該試劑盒能在15min內檢測出裂谷熱病毒RNA。