[發明專利]一種GI.1型札幌病毒基因組擴增引物和擴增方法

有效

• 申請號: 201810644193.2
• 申請日: 2018-06-21
• 公開（公告）號: CN108893467B
• 公開（公告）日: 2022-02-15
• 發明（設計）人: 薛亮;吳清平;蔡淑珍;蔡偉程;張樂;張菊梅
• 申請（專利權）人: 廣東省微生物研究所（廣東省微生物分析檢測中心）;廣東環凱微生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

本發明公開了一種GI.1型札幌病毒基因組擴增引物和擴增方法。本發明針對GI.1型札幌病毒基因群，根據其基因組特征采用了“4+1+1”的分段擴增策略，在保守區域設計了六組擴增引物和一條5'端測序引物，以目標病毒RNA為模板進行RT?PCR擴增與測序，再通過拼接比對，獲得GI.1型札幌病毒基因組全長序列。在優化反應條件下，六組擴增引物的靈敏度均能達到或超過常規檢測引物；將該擴增引物應用于實際檢出樣本，獲得了我國GI.1型札幌病毒樣本的基因組序列。本發明可廣泛應用于醫療衛生、檢驗檢疫等具有札幌病毒檢測需求的機構以及相應的科研領域。

技術領域：

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種GI.1型札幌病毒基因組擴增引物和擴增方法。

背景技術：

札幌病毒(Sapovirus,SaV)是目前全球急性胃腸炎的重要腸道病毒之一，尤其在嬰幼兒中普遍存在，對于高危人群還存在致死的危險。除感染人類外，SaV還從多種動物中獲得檢出，也是養殖業中導致動物腹瀉的常見病原。隨著分子生物學技術在病毒檢測領域的快速發展與應用，SaV的危害得到了廣泛的認識，其感染與流行水平成為了各國關注的公共衛生安全問題。目前仍沒有有效的病毒疫苗以及治療手段。

SaV屬于杯狀病毒科(Caliciviridae)札幌病毒屬，它具有一個大小為7.1-7.7kb的單鏈正義RNA基因組，包括了2個開放閱讀框(open reading frames,ORFs)。其中，病毒的ORF1編碼一個前體蛋白和一個主要衣殼蛋白VP1。前體蛋白經蛋白酶分解后可形成六個非結構蛋白。VP1是組成病毒衣殼的基本元件，蛋白大小為60kDa左右，可以分成四個結構域，分別為N端可變區、N端區、中間可變區、以及C端區。其中，中間可變區是病毒基因組上最易變異的區域，是病毒免疫原性的主要決定區。病毒ORF2能夠編碼一種小衣殼蛋白VP2，但它的功能目前還不清楚。此外，對于來自蝙蝠以及某些人源的SaV，其病毒基因組上還存在ORF3。

作為RNA病毒，SaV具有豐富的遺傳多樣性。根據衣殼蛋白VP1全長序列進行分類，SaV能夠分成GI-GV共5個基因群(Genogroup)，其中GI、GII、GIV和GV可以感染人類。不同基因群可以進一步分成不同的基因型(Genotype)，例如人源GI和GII可各分成7個基因型，GV包括2個基因型，GIV僅為1個，病毒重組現象在SaV進化過程中普遍存在的。目前GI.1是在SaV相關急性胃腸炎中檢出率最高的基因型，然而關于該型別的基因組信息仍非常有限，尤其是在獲得長片段或病毒全長基因組方面。目前GenBank中已報道的基因組僅三十余條。因此，在未來的SaV研究中，需要在病毒流行監測過程中進一步加強病毒遺傳信息的積累工作，有必要提供一種針對GI.1型SaV基因組的擴增引物和擴增方法，為積累GI.1型SaV基因組序列資源提供了一個有力的研究工具。

發明內容：

本發明的目的是提供一種GI.1型札幌病毒基因組擴增引物和擴增方法。

本發明人在前期食源性病毒研究積累的基礎上，針對SaV基因組特征開發了一種“4+1+1”的分段擴增策略，通過在保守區域設計擴增引物和測序引物，從而建立起一種靈敏度高、操作簡單、時效性好以及易推廣的病毒基因組擴增方法。

具體地，本發明提供的GI.1型札幌病毒基因組擴增引物，包括六對擴增引物和一條5'端測序引物：

引物對1：SaV-I.1-1F：5'-GTGATTGGTTAGATGGYTTCC-3'；

SAV-I.1-1R：5'-GCRATCCCAATCATYGTYTC-3'；

引物對2：SAV-I.1-2F：5'-CCCARGCAAACAACATYAG-3'；

SAV-I.1-2R：5'-CCACTCRTCATACTCATC-3'；

引物對3：SAV-I.1-3F：5'-TGTGAGGTGGTTGCMGA-3'；