[發(fā)明專利]一種豬干擾素α生物學(xué)活性檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810642055.0
• 申請日: 2018-06-21
• 公開（公告）號: CN108845144A
• 公開（公告）日: 2018-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 單雪芹;王亞男;徐文俊;趙雨;蔣敏之;何志遠(yuǎn);郭志燕
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽九川生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/533;C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 北京科家知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11427
• 代理人: 陳娟

本發(fā)明公開了一種豬干擾素α生物學(xué)活性檢測方法及其應(yīng)用。該方法包括以下步驟：采用PCR擴(kuò)增獲取豬Mx1蛋白的pMx1的基因片段；去除pEGFP?N1載體質(zhì)粒的pCMV；用PCR擴(kuò)增獲得的豬Mx1蛋白的pMx1的基因片段通過T4DNA連接酶替換原pEGFP?N1載體質(zhì)粒的pCMV，構(gòu)建pEGFP?N1?pMx1質(zhì)粒；用pEGFP?N1?pMx1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并通過新霉素篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株；對篩選出的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，加入豬干擾素α與克隆化培養(yǎng)后的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株共孵育，會激活Mx1基因啟動子活性促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)EGFP的表達(dá)，通過激發(fā)光源照射后細(xì)胞發(fā)出熒光的強(qiáng)度與豬干擾素α的生物學(xué)活性呈正相關(guān)，因此可以定量評價(jià)豬干擾素α的生物學(xué)活性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種豬干擾素α生物學(xué)活性檢測方法，屬于干擾素活性檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

干擾素(IFN)是細(xì)胞和機(jī)體受到病毒感染，或者受核酸、細(xì)菌內(nèi)毒素和促細(xì)胞分裂素等的作用后，由受體細(xì)胞分泌的一種廣譜抗病毒糖蛋白。根據(jù)干擾素的來源和理化性質(zhì)，可將其分為I型、II型和III干擾素。I型干擾素包括IFN-α，IFN-β，和IFN-τ；II型干擾素即IFN-γ；III干擾素即IL-28A，IL-28B和IL-29。

IFN-α有四個(gè)主要功能。第一，可以使感染病毒的細(xì)胞及其周圍細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)源性抗病毒狀態(tài)，限制病毒的傳播；第二，維持天然免疫反應(yīng)處于平衡狀態(tài)，促進(jìn)抗原遞呈和NK細(xì)胞功能的同時(shí)抑制促炎信號通路和細(xì)胞因子的產(chǎn)生；第三，激活獲得性免疫系統(tǒng)，促進(jìn)高親和力抗原特異性T細(xì)胞的產(chǎn)生，促進(jìn)B細(xì)胞反應(yīng)和免疫記憶；第四，具有抑制病毒增殖的作用。

IFN-α的作用機(jī)制在25年前已經(jīng)闡明，IFN與受體結(jié)合激活受體相關(guān)JAK1和TYK2，使STAT1和STAT2絡(luò)氨酸磷酸化，磷酸化的STAT1和STAT2形成二聚體并轉(zhuǎn)移入核，裝配IFN調(diào)節(jié)因子9(IRF9)形成3聚體的IFN刺激因子3(ISGF3)。ISGF3與其同源DNA序列(IFN刺激反應(yīng)元件，ISREs)結(jié)合，直接激活I(lǐng)SGs轉(zhuǎn)錄，使宿主細(xì)胞進(jìn)入抗病毒狀態(tài)。ISG抑制病毒的途徑主要有，抑制病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯和核酸復(fù)制；降解病毒核酸；改變宿主細(xì)胞脂代謝。因此，只要檢測到ISGs的啟動子活性增加就可以直接反應(yīng)IFN-α的生物學(xué)活性。

IFN-α可以經(jīng)JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活Mx啟動子(Mx promoter，pMx)，促進(jìn)Mx的表達(dá)，Mx能夠抑制負(fù)鏈RNA病毒復(fù)制。在豬中存在Mx1和Mx2兩種蛋白，其中Mx1起主要作用。pMx有較好的專一性，它不能被白細(xì)胞介素和腫瘤壞死因子等其它細(xì)胞因子啟動，能夠準(zhǔn)確反應(yīng)IFN-α生物學(xué)功能。

目前檢測干擾素生物學(xué)活性主要有3種方法：病毒復(fù)制抑制、噬斑減少分析和細(xì)胞病變抑制。但這3種方法都容易產(chǎn)生較大誤差，重復(fù)性不好，準(zhǔn)確度低。最近pMx-Luciferase(熒光素酶)系統(tǒng)已經(jīng)開始用于I型干擾素生物學(xué)活性檢測，該系統(tǒng)檢測的是IFN激活pMx的能力，不存在假陽性；整個(gè)過程完全避免VSV等活病毒的使用，沒有生物安全的顧慮；檢測程序簡化，時(shí)間大大縮短，在IFN處理細(xì)胞后約6h即可完成檢測，檢測速度快；熒光素酶的表達(dá)可以通過儀器檢測精確量化，不僅提高了IFN定量的準(zhǔn)確性，更便于大量樣品的高通量操作。但該方法基于質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染為基礎(chǔ)，每次需要準(zhǔn)備內(nèi)參照質(zhì)粒，并保證質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率一致才能夠得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，因此在一般實(shí)驗(yàn)室很難開展，而且需要使用熒光素酶底物，增加了使用成本。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種利用綠色熒光蛋白(EGFP)的豬干擾素α生物學(xué)活性檢測方法，該方法不需要內(nèi)參照質(zhì)粒，能夠簡化檢測過程，不需要重復(fù)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，提高準(zhǔn)確性和重復(fù)性，實(shí)用性更強(qiáng)。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：

一種豬干擾素α生物學(xué)活性檢測方法，其包括以下步驟：

采用PCR擴(kuò)增獲取豬Mx1蛋白的pMx1的基因片段；