[發(fā)明專利]一種豬干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810642055.0
• 申請(qǐng)日: 2018-06-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108845144A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 單雪芹;王亞男;徐文俊;趙雨;蔣敏之;何志遠(yuǎn);郭志燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽九川生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/68
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/68;G01N33/533;C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 北京科家知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11427
• 代理人: 陳娟

1.一種豬干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法，其包括以下步驟：

采用PCR擴(kuò)增獲取豬Mx1蛋白的pMx1的基因片段；

用PCR擴(kuò)增獲得的豬Mx1蛋白的pMx1的基因片段通過(guò)T4DNA連接酶替換原pEGFP-N1載體質(zhì)粒中的pCMV的基因片段，構(gòu)建pEGFP-N1-pMx1質(zhì)粒；

用pEGFP-N1-pMx1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并通過(guò)新霉素篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株；

對(duì)篩選出的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行克隆化培養(yǎng)；

以梯度稀釋的豬干擾素α標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定干擾素效價(jià)與熒光值之間的數(shù)學(xué)邏輯關(guān)系；

將待檢豬干擾素α樣品加入克隆化培養(yǎng)后的細(xì)胞中，然后檢測(cè)熒光強(qiáng)度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線評(píng)價(jià)待檢豬干擾素α樣品的效價(jià)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法，其特征在于，采用PCR擴(kuò)增獲取豬Mx1蛋白的pMx1的基因片段的步驟包括：

根據(jù)Genebank中已公布的豬Mx1蛋白的基因序列，選擇5'端含有ISRE反應(yīng)元件的啟動(dòng)子區(qū)域，設(shè)計(jì)PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

然后通過(guò)雙酶切后，再通過(guò)切膠回收純化獲得pMx1的基因片段。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法，其特征在于，用PCR擴(kuò)增獲得的豬Mx1蛋白的pMx1的基因片段通過(guò)T4DNA連接酶替換原pEGFP-N1載體質(zhì)粒中的pCMV的基因片段，構(gòu)建pEGFP-N1-pMx1質(zhì)粒的步驟包括：

去除pEGFP-N1載體質(zhì)粒中的pCMV的基因片段；

通過(guò)T4DNA連接酶用pMx1的基因片段替換原pEGFP-N1載體質(zhì)粒中的pCMV的基因片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-pMx1；

轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，搖菌，提取重組質(zhì)粒，通過(guò)DNA測(cè)序獲得重組質(zhì)粒的pMx1片段的DNA序列，選擇正確序列的重組質(zhì)粒；

所述正確序列如序列1所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法，其特征在于，用pEGFP-N1-pMx1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并通過(guò)新霉素篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的步驟包括：

通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑將pEGFP-N1-pMx1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，轉(zhuǎn)染96h后，換成含2μg/mL新霉素的完全培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)14日，篩選出具有新霉素抗性的細(xì)胞，即為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法，其特征在于，所述克隆化培養(yǎng)為將篩選出的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株通過(guò)有限稀釋培養(yǎng)法培養(yǎng)，從而獲得單個(gè)細(xì)胞形成的克?。?/p>

優(yōu)選的，在對(duì)篩選出的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行克隆化培養(yǎng)的步驟中還包括對(duì)克隆后的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)PCR鑒定細(xì)胞基因組中是否含有pMx1基因。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的豬干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法，其特征在于：pMx1的基因片段序列為序列1所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的豬干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法，其特征在于：去除pEGFP-N1載體質(zhì)粒中的pCMV的方法為雙酶切法。

8.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的豬干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法，其特征在于：所述細(xì)胞為pk-15細(xì)胞。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法，其特征在于：所述的豬干擾素α標(biāo)準(zhǔn)品為公告號(hào)為CN101736062B的專利所揭示的一種重組豬α干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法制備得到的重組豬α干擾素。

10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的豬干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法在對(duì)天然或重組豬干擾素α進(jìn)行生物學(xué)活性檢測(cè)中的應(yīng)用。