[發(fā)明專利]一種犬干擾素α生物學活性檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810642003.3
• 申請日: 2018-06-21
• 公開（公告）號: CN108761087A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發(fā)明（設計）人: 單雪芹;凡玉芳;許高濤;趙雨;蔣敏之;何志遠;郭志燕
• 申請（專利權）人: 安徽九川生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/533;C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 北京科家知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 陳娟

本發(fā)明公開了一種犬干擾素α生物學活性檢測方法及其應用。該方法包括以下步驟：采用PCR擴增獲取犬Mx蛋白的Mxp的基因片段；去除pEGFP?N1載體質(zhì)粒的pCMV；用PCR擴增獲得的犬Mx蛋白的Mxp的基因片段通過T4DNA連接酶替換原pEGFP?N1載體質(zhì)粒中的pCMV，構(gòu)建pEGFP?N1?Mxp質(zhì)粒；用pEGFP?N1?Mxp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，并通過新霉素篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株；對篩選出的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株進行克隆化培養(yǎng)，加入犬干擾素α與克隆化培養(yǎng)后的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株共孵育，會激活Mx基因啟動子活性促進細胞內(nèi)EGFP的表達，通過激發(fā)光源照射后細胞發(fā)出熒光的強度與犬干擾素α的生物學活性呈正相關，因此可以定量評價犬干擾素α的生物學活性。

技術領域

本發(fā)明涉及一種犬干擾素α生物學活性檢測方法，屬于干擾素活性檢測技術領域。

背景技術

干擾素(IFN)是細胞和機體受到病毒感染，或者受核酸、細菌內(nèi)毒素和促細胞分裂素等的作用后，由受體細胞分泌的一種廣譜抗病毒糖蛋白。根據(jù)干擾素的來源和理化性質(zhì)，可將其分為I型、II型和III干擾素。I型干擾素包括IFN-α，IFN-β，和IFN-τ；II型干擾素即IFN-γ；III干擾素即IL-28A，IL-28B和IL-29。

IFN-α有四個主要功能。第一，可以使感染病毒的細胞及其周圍細胞進入內(nèi)源性抗病毒狀態(tài)，限制病毒的傳播；第二，維持天然免疫反應處于平衡狀態(tài)，促進抗原遞呈和NK細胞功能的同時抑制促炎信號通路和細胞因子的產(chǎn)生；第三，激活獲得性免疫系統(tǒng)，促進高親和力抗原特異性T細胞的產(chǎn)生，促進B細胞反應和免疫記憶；第四，具有抑制病毒增殖的作用。

IFN-α的作用機制在25年前已經(jīng)闡明，IFN與受體結(jié)合激活受體相關JAK1和TYK2，使STAT1和STAT2絡氨酸磷酸化，磷酸化的STAT1和STAT2形成二聚體并轉(zhuǎn)移入核，裝配IFN調(diào)節(jié)因子9(IRF9)形成3聚體的IFN刺激因子3(ISGF3)。ISGF3與其同源DNA序列(IFN刺激反應元件，ISREs)結(jié)合，直接激活ISGs轉(zhuǎn)錄，使宿主細胞進入抗病毒狀態(tài)。ISG抑制病毒的途徑主要有，抑制病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯和核酸復制；降解病毒核酸；改變宿主細胞脂代謝。因此，只要檢測到ISGs的啟動子活性增加就可以直接反應IFN-α的生物學活性。

IFN-α可以經(jīng)JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導途徑激活Mx啟動子(Mx promoter，Mxp)，促進Mx的表達，Mx能夠抑制負鏈RNA病毒復制。在犬中存在Mx和Mx2兩種蛋白，其中Mx起主要作用。Mxp有較好的專一性，它不能被白細胞介素和腫瘤壞死因子等其它細胞因子啟動，能夠準確反應IFN-α生物學功能。

目前檢測干擾素生物學活性主要有3種方法：病毒復制抑制、噬斑減少分析和細胞病變抑制。但這3種方法都容易產(chǎn)生較大誤差，重復性不好，準確度低。最近Mxp-Luciferase(熒光素酶)系統(tǒng)已經(jīng)開始用于I型干擾素生物學活性檢測，該系統(tǒng)檢測的是IFN激活Mxp的能力，不存在假陽性；整個過程完全避免VSV等活病毒的使用，沒有生物安全的顧慮；檢測程序簡化，時間大大縮短，在IFN處理細胞后約6h即可完成檢測，檢測速度快；熒光素酶的表達可以通過儀器檢測精確量化，不僅提高了IFN定量的準確性，更便于大量樣品的高通量操作。但該方法基于質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染為基礎，每次需要準備內(nèi)參照質(zhì)粒，并保證質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率一致才能夠得到準確的檢測結(jié)果，因此在一般實驗室很難開展，而且需要使用熒光素酶底物，增加了使用成本。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于上述現(xiàn)有技術存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種利用綠色熒光蛋白(EGFP)的犬干擾素α生物學活性檢測方法，該方法不需要內(nèi)參照質(zhì)粒，能夠簡化檢測過程，不需要重復進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，提高準確性和重復性，實用性更強。

本發(fā)明的目的通過以下技術方案得以實現(xiàn)：

一種犬干擾素α生物學活性檢測方法，其包括以下步驟：

采用PCR擴增獲取犬Mx蛋白的Mxp的基因片段；