[發明專利]一種犬干擾素α生物學活性檢測方法

在審

• 申請號: 201810642003.3
• 申請日: 2018-06-21
• 公開（公告）號: CN108761087A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發明（設計）人: 單雪芹;凡玉芳;許高濤;趙雨;蔣敏之;何志遠;郭志燕
• 申請（專利權）人: 安徽九川生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/533;C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 陳娟

1.一種犬干擾素α生物學活性檢測方法，其包括以下步驟：

采用PCR擴增獲取犬Mx蛋白的Mxp的基因片段；

用PCR擴增獲得的犬Mx蛋白的Mxp的基因片段通過T4DNA連接酶替換原pEGFP-N1載體質粒中的pCMV的基因片段，構建pEGFP-N1-Mxp質粒；

用pEGFP-N1-Mxp質粒轉染細胞，并通過新霉素篩選出穩定轉染細胞株；

對篩選出的穩定轉染細胞株進行克隆化培養；

以梯度稀釋的犬干擾素α標準品制備標準曲線，確定干擾素效價與熒光值之間的數學邏輯關系；

將待檢犬干擾素α樣品加入克隆化培養后的細胞中，然后檢測熒光強度，結合標準曲線評價待檢犬干擾素α樣品的效價。

2.根據權利要求1所述的犬干擾素α生物學活性檢測方法，其特征在于，采用PCR擴增獲取犬Mx蛋白的Mxp的基因片段的步驟包括：

根據Genebank中已公布的犬Mx蛋白的基因序列，選擇5'端含有ISRE反應元件的啟動子區域，設計PCR引物，進行PCR擴增；

然后通過雙酶切后，再通過切膠回收純化獲得Mxp的基因片段。

3.根據權利要求1所述的犬干擾素α生物學活性檢測方法，其特征在于，用PCR擴增獲得的犬Mx蛋白的Mxp的基因片段通過T4DNA連接酶替換原pEGFP-N1載體質粒中的pCMV的基因片段，構建pEGFP-N1-Mxp質粒的步驟包括：

去除pEGFP-N1載體質粒的pCMV的基因片段；

通過T4DNA連接酶用Mxp的基因片段替換原pEGFP-N1載體質粒中的pCMV的基因片段，構建重組質粒pEGFP-N1-Mxp；

轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，搖菌，提取重組質粒，通過DNA測序獲得重組質粒的Mxp片段的DNA序列，選擇正確序列的重組質粒；

所述正確序列如序列1所示。

4.根據權利要求1所述的犬干擾素α生物學活性檢測方法，其特征在于，用pEGFP-N1-Mxp質粒轉染細胞，并通過新霉素篩選出穩定轉染細胞株的步驟包括：

通過轉染試劑將pEGFP-N1-Mxp質粒轉染至細胞，轉染96h后，換成含2μg/mL新霉素的完全培養基持續培養14日，篩選出具有新霉素抗性的細胞，即為穩定轉染細胞株。

5.根據權利要求1所述的犬干擾素α生物學活性檢測方法，其特征在于，所述克隆化培養為將篩選出的穩定轉染細胞株通過有限稀釋培養法培養，從而獲得單個細胞形成的克隆；

優選的，在對篩選出的穩定轉染細胞株進行克隆化培養的步驟中還包括對克隆后的細胞進行檢測，通過PCR鑒定細胞基因組中是否含有Mxp基因。

6.根據權利要求1或2所述的犬干擾素α生物學活性檢測方法，其特征在于：Mxp的基因片段序列為序列1所示。

7.根據權利要求3所述的犬干擾素α生物學活性檢測方法，其特征在于：去除pEGFP-N1載體質粒的pCMV的方法為雙酶切法。

8.根據權利要求1或4所述的犬干擾素α生物學活性檢測方法，其特征在于：所述細胞為MDCK細胞。

9.根據權利要求1所述的犬干擾素α生物學活性檢測方法，其特征在于：所述的犬干擾素α標準品為公布號為CN106282279A的專利所揭示的一種重組犬干擾素α標準品、其制備方法及效價測定方法制備得到的重組犬α干擾素。

10.權利要求1-9任一項所述的犬干擾素α生物學活性檢測方法在對天然或重組犬干擾素α進行生物學活性檢測中的應用。