[發明專利]一種衍生化的含游離氨基的硫酸類肝素二糖的分離分析方法

有效

• 申請號: 201810640001.0
• 申請日: 2018-06-21
• 公開（公告）號: CN108802248B
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發明（設計）人: 魏崢;杜佳燕;林江慧
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/88
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明公開了一種衍生化的含游離氨基的硫酸類肝素二糖的分離分析方法，該二糖質量和質譜檢測峰面積的函數關系可用于實際生物樣品中肝素和硫酸類肝素二糖的定量檢測。本發明能在液相?質譜分析中檢測肝素和硫酸類肝素二糖，尤其是含有游離氨基的硫酸類肝素二糖，也可利用常規液相色譜分離并結合紫外和熒光檢測器來進行分析。這對研究臨床藥物肝素、硫酸類肝素、肝素衍生物和各種生物樣品的二糖組分有重要的作用。

技術領域

本發明屬于藥物檢測技術領域，具體涉及一種衍生化的含游離氨基的硫酸類肝素二糖的分離分析方法。

背景技術

肝素和硫酸類肝素是線性糖胺聚糖，由于肝素具有較強的抗凝作用，被廣泛運用于治療血栓栓塞性疾病、心肌梗死等疾病。肝素中不同的硫酸化、乙酰化和游離氨基取代模式形成了不同的二糖單元，賦予了肝素和硫酸類肝素眾多的生物功能，參與了血管形成、血液凝固、細胞粘附及增生和腫瘤轉移等生命活動。肝素和硫酸類肝素由重復的二糖單元組成，二糖單元由己糖醛酸和葡萄糖胺以1-4糖苷鍵連接而成，其中十二種代表性的二糖單元中存在常規的N-硫酸化葡萄糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺和稀有的含游離氨基的葡萄糖胺殘基。

最近有研究發現，含游離氨基的硫酸類肝素在乳腺癌細胞中的濃度相當高，可抑制乙酰肝素酶的活性。利用人工化學合成含游離氨基的葡萄糖胺殘基的四糖進行體外實驗，發現它通過競爭性抑制乙酰肝素酶的活性從而進一步抑制了乳腺癌細胞的轉移[S.Nadanaka, et al. J. Biol. Chem., 2014，289:15231-43]。此外有報道指出，含游離氨基的硫酸類肝素通過抑制腫瘤組織中血管生成和血管內皮生長因子的表達和血管生成，從而抑制腫瘤的轉移[陳金聯等. 世界華人消化雜志, 2005, 13(22):2685-2688]。含游離氨基的硫酸類肝素有希望成為抗腫瘤活性抑制劑。因此無論是天然的硫酸類肝素/肝素或人工合成的衍生物，構建含游離氨基的硫酸類肝素二糖的分離和分析方法具有極大的挑戰，也是更好地理解含游離氨基的硫酸類肝素的生物功能的基礎。

分析肝素和硫酸類肝素的組分含量時，通常使用肝素酶酶解產生12種主要的肝素/硫酸類肝素二糖，再對二糖進行分析測定。傳統的分析肝素/硫酸類肝素二糖的技術包括高效液相色譜[Wei Z, et al. J. Biol. Chem., 2005, 280(16):15742]、毛細管電泳法[Hitchcock A M, et al. Electrophoresis, 2008, 29(23):4538-4548]、凝膠色譜法[Chuang W L, et al. J Chromatogr A, 2001, 932(1):65-74]、排阻液相色譜-質譜聯用技術、親水液相色譜-質譜聯用技術[Gill V L, et al. Anal. Chem., 2013, 85:1138-1145]等。這些分析技術主要用于分析8種常規肝素/硫酸類肝素二糖。進一步地，專利CN104914205B公開了一種一種含N -非取代葡萄糖胺（GlcNH₃⁺）硫酸類肝素二糖的分離分析方法，該質譜峰面積校正因子可用于實際生物樣品中硫酸類肝素和肝素二糖的定量檢測，但是該方法采用胺類離子對試劑進行分析。目前普遍認為離子對試劑存在污染質譜的離子源的風險，會導致質譜靈敏度的下降[Yang B, et al. Anal. Biochem., 2011, 415(1):59-66]。

因此，建立分析肝素/硫酸類肝素二糖的新方法，減少分析過程中對質譜的損傷具有重要的意義。而2-氨基吖啶酮(2-aminoacridone, AMAC)是熒光疏水性分子，能與肝素/硫酸類肝素二糖發生還原胺化反應從而連接到二糖上。同時，熒光疏水性分子標記技術能促進肝素/硫酸類肝素二糖的分離。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種衍生化的含游離氨基的硫酸類肝素二糖的分離分析方法，本發明能在液相-質譜分析中檢測硫酸類肝素二糖，尤其是含游離氨基的硫酸類肝素二糖，也可利用常規液相色譜分離并結合紫外和熒光檢測器來進行分析。這對研究臨床藥物肝素、硫酸類肝素、肝素衍生物和各類生物樣品的二糖組分具有重要的作用。