[發(fā)明專利]一種衍生化的含游離氨基的硫酸類肝素二糖的分離分析方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810640001.0
• 申請(qǐng)日: 2018-06-21
• 公開（公告）號(hào): CN108802248B
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏崢;杜佳燕;林江慧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福州大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/06
• 分類號(hào): G01N30/06;G01N30/88
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

1.一種衍生化的含游離氨基的硫酸類肝素二糖的分離分析方法，其特征在于：具體步驟如下：

（1）將銨鹽試劑溶解于去離子水中，用pH調(diào)節(jié)試劑調(diào)pH值至5.2-6.0，制得濃度為20mM-80mM的流動(dòng)相A；將醇類試劑作為流動(dòng)相B；

（2）將待測(cè)的硫酸類肝素二糖各自溶解于去離子水中，配制成濃度為1mg/mL的二糖溶液；取等量的12種二糖，配制成二糖混合物，凍干；

（3）將熒光疏水性的標(biāo)記試劑溶于乙酸：二甲亞砜（v/v）=3：17的溶劑中，制得濃度為0.05-0.2mol/L的標(biāo)記試劑溶液；將氰基硼氫化鈉溶于去離子水中，制得濃度為0.5-2.0mol/L的氰基硼氫化鈉溶液；

（4）用（3）中的標(biāo)記溶液標(biāo)記（2）中的干燥混合二糖，反應(yīng)20min后，加入氰基硼氫化鈉溶液，混合均勻，30-50℃水浴反應(yīng)2-6小時(shí)；用50%(v/v)的二甲亞砜將上述標(biāo)記的二糖混合物稀釋到20-40ng/μL的二糖濃度，配制成多組不同二糖濃度的待測(cè)二糖溶液；

（5）將標(biāo)記后的多組不同濃度的硫酸類肝素標(biāo)準(zhǔn)二糖用以下色譜條件進(jìn)行分離：ODS-2HYPERSIL C18色譜柱，流速為0.3mL/min，洗脫梯度為0-100min：98%-80%流動(dòng)相A、2%-20%流動(dòng)相B，100min-120min：80%-50%流動(dòng)相A、20%-50%流動(dòng)相B；PDA檢測(cè)器在200nm-600nm全波段檢測(cè)的條件下檢測(cè)分離色譜圖；其中流動(dòng)相A為銨鹽溶液，流動(dòng)相B為甲醇試劑；

（6）通過質(zhì)譜檢測(cè)得到質(zhì)譜檢測(cè)峰面積，計(jì)算出各種二糖的質(zhì)量和質(zhì)譜檢測(cè)峰面積的函數(shù)關(guān)系，再計(jì)算出硫酸類肝素二糖的百分含量；

其中硫酸類肝素二糖具體為：DHexA(2S)–GlcNS(6S)、DHexA–GlcNS(6S)、DHexA(2S)–GlcNS、DHexA–GlcNS、DHexA(2S)-GlcNH₃⁺(6S)、DHexA(2S)–GlcNAc(6S)、DHexA-GlcNH₃⁺(6S)、DHexA–GlcNAc(6S)、DHexA(2S)-GlcNH₃⁺、DHexA(2S)–GlcNAc、DHexA-GlcNH₃⁺、DHex–GlcNAc。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的銨鹽試劑為乙酸銨；pH調(diào)節(jié)試劑為乙酸。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的熒光疏水性標(biāo)記物為2-氨基吖啶酮。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（5）中的液相-質(zhì)譜采用反相液相色譜串聯(lián)電噴霧離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜，設(shè)定參數(shù)為：負(fù)離子模式錐孔電壓為-3.5kV，干燥氣流速為1.5L/min，Heat block CDL溫度為200℃。