[發明專利]一種腫瘤浸潤淋巴細胞TIL的體外擴增方法

在審

• 申請號: 201810639632.0
• 申請日: 2018-06-20
• 公開（公告）號: CN108707580A
• 公開（公告）日: 2018-10-26
• 發明（設計）人: 何英廣;馬思航
• 申請（專利權）人: 淮安諾康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種體外擴增腫瘤浸潤淋巴細胞TIL的方法，其特征在于：正式培養前使用含有抗CD3單抗、抗CD28單抗和益智仁萜二醇A或益智仁萜二醇B的培養基孵育24h。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，具體步驟為：

步驟S1、TIL細胞分離

取癌癥患者手術切除的新鮮癌旁組織浸泡于PBS中，剔除周圍的血塊、脂肪及壞死組織，PBS清洗一遍，剪成1mm³大小，浸入0.1μg/mL的IV型膠原酶溶液中，37℃水浴消化2h。消化完畢后用100μm孔徑的網篩過濾，用PBS沖洗組織塊，收集濾液。細胞濾液在常溫下離心，1500r/min×5min。棄上清，加入PBS制成細胞懸液后，用淋巴細胞分離液作不連續密度梯度離心。離心結束后收取下層界面的淋巴細胞，經PBS清洗后，按1×10⁶/mL的濃度懸浮于含10％人AB型血清和IL-2的X-VIVO-15培養基內，接種于12孔板上，3mL/孔，置于37℃、5％CO₂培養箱內培養，每3～5d換液一次。

步驟S2、培養和擴增

當孔里的淋巴細胞生長至1×10⁷時，將其轉入含有抗CD3單抗、抗CD28單抗和益智仁萜二醇A或益智仁萜二醇B的培養瓶內孵育，孵育24h后加入IL-2，置于37℃、5％CO₂培養箱內連續培養，培養過程中每隔2～3d半量更換含同等濃度IL-2的新鮮X-VIVO-15培養基，培養22～25d后收獲體外擴增的TIL。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟S1中IL-2的濃度為2000IU/mL。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：抗CD3單抗濃度為20ng/mL。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：抗CD28單抗濃度為20ng/mL。

6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：益智仁萜二醇A或益智仁萜二醇B的濃度為20μg/mL。

7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟S2中IL-2的濃度為4000IU/mL。

8.一種用于體外擴增腫瘤浸潤淋巴細胞TIL的培養基，其特征在于：通過在X-VIVO-15培養基中添加20μg/mL的益智仁萜二醇A或益智仁萜二醇B配制而成。

9.根據權利要求8所述的培養基，其特征在于：還含有20ng/mL的抗CD3單抗。

10.根據權利要求8所述的培養基，其特征在于：還含有20ng/mL的抗CD28單抗。