[發(fā)明專利]一種腫瘤浸潤淋巴細胞TIL的體外擴增方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810639632.0
• 申請日: 2018-06-20
• 公開（公告）號: CN108707580A
• 公開（公告）日: 2018-10-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何英廣;馬思航
• 申請（專利權(quán)）人: 淮安諾康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種腫瘤浸潤淋巴細胞TIL的體外擴增方法，步驟為：步驟S1、TIL細胞分離：取癌旁組織剪碎浸入膠原酶溶液消化，過濾，PBS沖洗，收集濾液，離心，棄上清，加入PBS制成細胞懸液，用淋巴細胞分離液作不連續(xù)密度梯度離心，離心結(jié)束后收取下層界面的淋巴細胞，經(jīng)PBS清洗后，按1×10⁶/mL的濃度懸浮于含10％人AB型血清和IL?2的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，每3～5d換液一次；步驟S2、培養(yǎng)和擴增：當孔里的淋巴細胞生長至1×10⁷時，將其轉(zhuǎn)入含抗CD3單抗、抗CD28單抗和藥物的培養(yǎng)瓶內(nèi)孵育，24h后加入IL?2連續(xù)培養(yǎng)，每隔2～3d半量更換含同等濃度IL?2的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)22～25d。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，涉及一種體外擴增腫瘤浸潤淋巴細胞TIL的方法。

背景技術(shù)

免疫治療是新興的一種腫瘤治療方式，已經(jīng)被列為繼手術(shù)、放療、化療后的第四種治療方式，在腫瘤的綜合治療中逐漸發(fā)揮重要作用。2010年，美國FDA批準世界上第一個細胞免疫治療產(chǎn)品Provenge上市，充分顯示出細胞免疫治療在腫瘤治療中的價值。

腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)是存在于腫瘤間質(zhì)內(nèi)的以淋巴細胞為主的異質(zhì)性淋巴細胞群體，大多聚集在腫瘤周圍或其間質(zhì)呈套狀圍繞癌巢。其主要成分是存在于腫瘤間質(zhì)內(nèi)的T淋巴細胞，小部分為MHC非限制性的NK細胞，其共同特征為表達T細胞受體(T cell receptor，TCR)。TIL來自腫瘤組織區(qū)域，可特異識別自體腫瘤，具有特異的MHC限制性溶解腫瘤活性。美國NCI的Rosenberg等首次證實，從實體瘤組織分離的TIL在體外經(jīng)IL-2激活并大量擴增后，可用于晚期黑色素瘤患者的治療，其治療效果遠遠高于之前發(fā)展的LAK(lymphokine activatedkiller cells)細胞治療技術(shù)(文獻：Expansion of human tumor infiltrating lymphocytes for use in immunotherapytrials.J Immunol Methods 1987)。近年發(fā)表的多篇臨床試驗報道顯示，TIL細胞免疫治療可治愈20％～40％晚期黑色素瘤，充分顯示出TIL作為細胞免疫治療手段在腫瘤治療中的潛力(文獻：Anew approach to the adoptive immunotherapy ofcancer withtumor-infiltrating lymphocytes.Science 1986)。

但是，目前體外擴增TIL的方法存在兩點不足：

第一，擴增效率不高，限制了腫瘤患者TIL的大量回輸使用；

第二，對腫瘤細胞的殺傷力還有待提高，回輸腫瘤患者體內(nèi)后對腫瘤的殺傷力不足。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種體外擴增腫瘤浸潤淋巴細胞TIL的方法，一方面提高TIL細胞的擴增效率，另一方面提高其對腫瘤細胞的殺傷力。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種體外擴增腫瘤浸潤淋巴細胞TIL的方法，正式培養(yǎng)前使用含有抗CD3單抗、抗CD28單抗和呋喃天竺葵酮A或呋喃天竺葵酮B的培養(yǎng)基孵育24h。

優(yōu)選地，具體步驟為：

步驟S1、TIL細胞分離