[發(fā)明專利]一種單分子標(biāo)簽及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810638123.6
• 申請日: 2018-06-20
• 公開（公告）號: CN108774640B
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張曉妮;屈宏越;許明炎
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳海普洛斯醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室
• 主分類號: C12Q1/6876
• 分類號: C12Q1/6876;C12Q1/6806;C40B40/06
• 代理公司: 深圳舍穆專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 44398
• 代理人: 黃賢炬

本發(fā)明提供了一種單分子標(biāo)簽及其應(yīng)用，所述標(biāo)簽為一條oligo退火形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)、兩條oligo退火形成兩端互補(bǔ)配對的結(jié)構(gòu)或兩條oligo退火形成一端互補(bǔ)配對的結(jié)構(gòu)中的任意一種，其中，所述標(biāo)簽的3’端突出，5’端磷酸化，在未互補(bǔ)配對的環(huán)狀結(jié)構(gòu)上，有尿嘧啶修飾；本發(fā)明通過選擇特定結(jié)構(gòu)和修飾后的標(biāo)簽，結(jié)合簡潔高效的引入方法，實(shí)現(xiàn)對DNA雙端單分子編碼標(biāo)記，更為有效的定位測序讀長的最初來源，節(jié)省人力物力，具有推廣應(yīng)用的前景和價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種單分子標(biāo)簽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

DNA測序作為一種非常重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在生物學(xué)研究領(lǐng)域中有著廣泛應(yīng)用，特別是在基因檢測行業(yè)。從最初的末端終止法，到目前比較成熟的第二代測序技術(shù)(Next-Generation Sequencing)。目前的二代測序較一代測序而言，費(fèi)用更低，通量更高，速度更快。

Illumina測序的基本原理是邊合成邊測序。在文庫構(gòu)建過程中，需要將基因組DNA隨機(jī)片段化，并在片段化后的基因組兩端添加特定測序接頭(Adaptor)，然后進(jìn)行文庫PCR擴(kuò)增。由于最后的PCR擴(kuò)增和片段化的隨機(jī)性，使得最終文庫測序的每個讀長存在一個問題，即不確定所得讀長最初是由哪個模版擴(kuò)增而來。CN106834503A提供了一種引物標(biāo)簽結(jié)合深度測序法從外周血游離DNA擴(kuò)增癌癥基因的引物組、引物標(biāo)簽設(shè)計方法及應(yīng)用，該發(fā)明通過給每個起始樣品DNA分子模板兩邊加標(biāo)簽的方式，給模板中的每個DNA分子都貼上分子標(biāo)簽，在經(jīng)過PCR和測序以后，可以通過分子標(biāo)簽將樣本中原始的DNA分子都鑒別分類，進(jìn)而可以通過標(biāo)簽去除或降低NGS測序中PCR擴(kuò)增以及測序階段引入的系統(tǒng)誤差。CN107254514A公開了一種檢測異源cfDNA的SNP分子標(biāo)記，基于SNP分子標(biāo)記設(shè)計的檢測探針和芯片，以及異源cfDNA的檢測裝置、試劑盒和檢測方法；SNP分子標(biāo)記中包括藥物代謝基因的SNP位點(diǎn)，為腎移植排斥患者提供用藥基因的突變信息，實(shí)現(xiàn)個體化用藥；該發(fā)明還提供了一種單分子標(biāo)記接頭，單分子標(biāo)記接頭用于構(gòu)建測序文庫有效去除重復(fù)數(shù)據(jù)和測序、PCR過程中隨機(jī)引入的錯誤，降低測序背景噪音，提高了檢測的準(zhǔn)確性。但上述現(xiàn)有技術(shù)均無法對測序讀長進(jìn)行有效溯源的目標(biāo)，且操作步驟復(fù)雜，對設(shè)備要求高，難以應(yīng)用推廣。

綜上，研發(fā)一種單分子標(biāo)簽及其應(yīng)用，對每條最初的DNA片段進(jìn)行標(biāo)記，從而在最終測序結(jié)果中呈現(xiàn)每條讀長的具體來源，具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的市場價值。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足及實(shí)際的需求，本發(fā)明提供一種單分子標(biāo)簽及其應(yīng)用，通過設(shè)計特異性的標(biāo)簽，并選擇與標(biāo)簽相適配的引入方法，在構(gòu)建文庫前期對DNA樣品進(jìn)行處理，以實(shí)現(xiàn)對每條最初的DNA片段進(jìn)行標(biāo)記，從而在最終測序結(jié)果中呈現(xiàn)每條讀長的具體來源，

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種單分子標(biāo)簽，所述標(biāo)簽為一條oligo退火形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)、兩條oligo退火形成兩端互補(bǔ)配對的結(jié)構(gòu)或兩條oligo退火形成一端互補(bǔ)配對的結(jié)構(gòu)中的任意一種，其中，所述標(biāo)簽的3’端突出，5’端磷酸化，在未互補(bǔ)配對的環(huán)狀結(jié)構(gòu)上，有尿嘧啶修飾。

優(yōu)選地，所述標(biāo)簽的尿嘧啶修飾的個數(shù)為至少1個。

優(yōu)選地，所述標(biāo)簽的3’端突出為懸突胸腺嘧啶。

在本發(fā)明中，發(fā)明人在深入研究DNA測序技術(shù)的基礎(chǔ)上，分析Illumina測序的優(yōu)缺點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)由于PCR擴(kuò)增和片段化的隨機(jī)性，導(dǎo)致無法得知最終測序文庫的所得讀長的來源模板，因此，為實(shí)現(xiàn)對測序樣本的單分子編碼測序，發(fā)明人通過大量實(shí)驗(yàn)并結(jié)合創(chuàng)造性思路，研發(fā)了一種特異性標(biāo)簽，最終實(shí)現(xiàn)對每條DNA片段進(jìn)行標(biāo)記，從而在最終的DNA文庫測序結(jié)果中呈現(xiàn)出每條讀長的具體來源。

本發(fā)明中，所述標(biāo)簽存在三種情況，當(dāng)一條鏈退火形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)；第二種情況：當(dāng)兩條鏈發(fā)生兩端互補(bǔ)配對時形成結(jié)構(gòu)；第三種情況：當(dāng)兩條鏈發(fā)生一端互補(bǔ)配對形成結(jié)構(gòu)，三種情況示意圖如圖1。