[發明專利]SD大鼠胃竇間質細胞的分離和培養方法

在審

• 申請號: 201810637537.7
• 申請日: 2018-06-20
• 公開（公告）號: CN108865973A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 譚人千;凌江紅;鞠靜;羅高標;文一惠
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 深圳新創友知識產權代理有限公司 44223
• 代理人: 關文龍

本發明提供了一種SD大鼠胃竇間質細胞的分離和培養方法，通過選用4~5周齡的SD大鼠為原體，剝離胃竇組織后，在Ⅱ型膠原酶的作用下，經過離心操作分離出ICC細胞，在M199完全培養基中培養后，再經過消化操作和離心處理，得到分離好的ICC細胞。本發明所述的方法，選用4~5周齡（110±10g）的SD大鼠作為實驗動物，避免了由于成年大鼠ICC細胞的高度分化，而造成細胞獲得率低的弊端，同時本發明調整了Ⅱ型膠原酶的濃度，避免了低濃度長時間消化或者高濃度短時間消化對細胞造成的損傷；采用細胞接觸抑制及優勢競爭的原理進行提純，避免了由于梯度離心對脆弱的細胞造成損傷。

技術領域

本發明屬于細胞提取方法領域，具體是涉及到SD大鼠胃竇間質細胞的分離和培養方法。

背景技術

胃竇間質細胞（ICC）是作為胃腸運動的起搏細胞，可以產生自主節律性慢波電位，通過突出及縫隙連接作用于胃腸的平滑肌細胞，促進平滑肌的節律性舒縮。而多種胃腸病如慢性傳輸型便秘、功能性消化不良、糖尿病胃輕癱等均與ICC的病理變化有關。現有的ICC原代細胞提取技術，多是采用成年SD大鼠，用Ⅱ型膠原酶消化，梯度離心法進行純化。但這種方式不能避免成年大鼠ICC細胞高度分化，不能避免梯度離心對細胞的損傷和丟失。

發明內容

本發明針對現有ICC細胞分離方法的缺陷，采用幼年4~5周齡（110±10g）的SD大鼠作為實驗動物，采用細胞接觸抑制及優勢競爭的原理進行提純，采用含有干細胞因子（SCF）的完全培養基進行培養，可以穩定、持續、高效獲得高表達率的ICC細胞。

本發明通過以下技術方案得以實現。

SD大鼠胃竇間質細胞的分離和培養方法，包括以下步驟：

S1、初步分離

選用4~5周齡的SD大鼠，禁食不禁水12h后，采取乙醚吸入麻醉，頸椎脫臼發處死；用75%乙醇濕潤腹部，無菌條件下打開腹腔，取出胃竇，沿胃小彎剪開，置于無菌玻璃皿內，使用溫度為3-5℃的PBS液反復沖洗3次，快速更換無菌玻璃皿并置于冰上，加入適量PBS液，解剖顯微鏡下用眼科剪和眼科鑷銳性分離胃粘膜及粘膜下層，將剝離后的組織置于含有M199完全培養基的試管中，并放于冰下，以保持細胞活性；

S2、分離出ICC細胞

將步驟S1中剝離好的胃竇肌層組織放于無菌安倍瓶里，加入2-3倍體積的M199完全培養基，置于冰上，并用眼科鑷快速的將組織剪碎成大小為1mm3的組織塊，將組織塊移至無菌試管中，加入6-10ml M199完全培養基，于冰上靜置5min，去掉上清液，加入Ⅱ型膠原酶3-5ml，蓋緊試管蓋并用封口膠封口，水浴鍋36-37℃中消化35~40min，水平放置，每10min觀察組織塊消化情況并輕柔的搖晃試管使組織與液體充分接觸，進行離心操作，加入M199完全培養基5ml，用粗口試管緩慢吹打6~10min，用200-300目篩網過濾，得到細胞懸液，移入細胞培養瓶中，十字法搖勻細胞懸液，使其分布均勻；

S3、提純ICC細胞

將步驟S2得到的分布均勻的細胞懸液，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，8h后觀察細胞貼壁情況，并棄細胞培養液，使用D-hanks液洗2次，加入4ml M199完全培養基，第一次換液后，每24h觀察細胞形態，每48h換液一次；第一代細胞于第7天到對數生長期，觀察并傳代，進行消化操作后，倒置顯微鏡下觀察消化情況，待細胞明顯收縮、細胞間隙增加時，加入3mlM199完全培養基終止消化，輕輕沿瓶底吹打2min，收集細胞懸液于離心管中，1200r/min離心5min，去掉上清液，得到分離好的ICC細胞。

進一步的，所述步驟S1中，剝離組織的要求為：應該快、準，減少對組織的損傷，以銳性分離為原則操作，每只胃竇處理時間控制在10分鐘內，在冰上操作。

進一步的，所述步驟S1中使用到的PBS液中含有2%的青霉素-鏈霉素溶液。