[發(fā)明專利]SD大鼠胃竇間質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810637537.7
• 申請日: 2018-06-20
• 公開（公告）號: CN108865973A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚人千;凌江紅;鞠靜;羅高標(biāo);文一惠
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 深圳新創(chuàng)友知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44223
• 代理人: 關(guān)文龍

1.SD大鼠胃竇間質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于：包括以下步驟：

S1、初步分離

選用4~5周齡的SD大鼠，禁食不禁水12h后，采取乙醚吸入麻醉，頸椎脫臼發(fā)處死；用75%乙醇濕潤腹部，無菌條件下打開腹腔，取出胃竇，沿胃小彎剪開，置于無菌玻璃皿內(nèi)，使用溫度為3-5℃的PBS液反復(fù)沖洗3次，快速更換無菌玻璃皿并置于冰上，加入適量PBS液，解剖顯微鏡下用眼科剪和眼科鑷銳性分離胃粘膜及粘膜下層，將剝離后的組織置于含有M199完全培養(yǎng)基的試管中，并放于冰下，以保持細(xì)胞活性；

S2、分離出ICC細(xì)胞

將步驟S1中剝離好的胃竇肌層組織放于無菌安倍瓶里，加入2-3倍體積的M199完全培養(yǎng)基，置于冰上，并用眼科鑷快速的將組織剪碎成大小為1mm³的組織塊，將組織塊移至無菌試管中，加入6-10ml M199完全培養(yǎng)基，于冰上靜置5min，去掉上清液，加入Ⅱ型膠原酶3-5ml，蓋緊試管蓋并用封口膠封口，水浴鍋36-37℃中消化35~40min，水平放置，每10min觀察組織塊消化情況并輕柔的搖晃試管使組織與液體充分接觸，進(jìn)行離心操作，加入M199完全培養(yǎng)基5ml，用粗口試管緩慢吹打6~10min，用200-300目篩網(wǎng)過濾，得到細(xì)胞懸液，移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，十字法搖勻細(xì)胞懸液，使其分布均勻；

S3、提純ICC細(xì)胞

將步驟S2得到的分布均勻的細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8h后觀察細(xì)胞貼壁情況，并棄細(xì)胞培養(yǎng)液，使用D-hanks液洗2次，加入4ml M199完全培養(yǎng)基，第一次換液后，每24h觀察細(xì)胞形態(tài)，每48h換液一次；第一代細(xì)胞于第7天到對數(shù)生長期，觀察并傳代，進(jìn)行消化操作后，倒置顯微鏡下觀察消化情況，待細(xì)胞明顯收縮、細(xì)胞間隙增加時(shí)，加入3mlM199完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕沿瓶底吹打2min，收集細(xì)胞懸液于離心管中，1200r/min離心5min，去掉上清液，得到分離好的ICC細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述SD大鼠胃竇間質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟S1中，剝離組織的要求為：應(yīng)該快、準(zhǔn)，減少對組織的損傷，以銳性分離為原則操作，每只胃竇處理時(shí)間控制在10分鐘內(nèi)，在冰上操作。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述SD大鼠胃竇間質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟S1中使用到的PBS液中含有2%的青霉素-鏈霉素溶液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述SD大鼠胃竇間質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟S2中，最后加入的M199完全培養(yǎng)基中，含有10%血清溶液及2%的青霉素-鏈霉素溶液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述SD大鼠胃竇間質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟S2中的Ⅱ型膠原酶的濃度為0.4-0.6%。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述SD大鼠胃竇間質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟S2中的離心操作為，試樣在1500r/min離心3min，去掉上清液，加入M199完全培養(yǎng)基重懸洗去消化液，吹打混勻后再在1500r/min離心3min，最后去掉上清液。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述SD大鼠胃竇間質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟S2中在水浴鍋中的消化溫度為36-37℃。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述SD大鼠胃竇間質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟S3中的消化操作為，細(xì)胞懸液使用D-hanks液洗2次后，分出D-hanks液，加入0.25%胰蛋白酶溶液2ml，于37℃消化1mim。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述SD大鼠胃竇間質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟S1-S3中使用的M199完全培養(yǎng)基中加入干細(xì)胞因子，加入的量為M199完全培養(yǎng)基體積的2-5%。