[發明專利]通用型靶向CD19抗原嵌合受體T細胞的制備及其應用

有效

• 申請號: 201810636413.7
• 申請日: 2018-06-20
• 公開（公告）號: CN110616189B
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發明（設計）人: 彭作翰;李玏
• 申請（專利權）人: 西安桑尼賽爾生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/113;C12N15/864;A61K35/17;A61P35/00;A61P35/02
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 關旭穎

1.一種制備靶向CD19抗原嵌合受體T細胞的方法，所述方法包括將基因編輯物質遞送至T細胞以剪切TRAC和B2M基因；和

將靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E融合基因克隆至修復模板載體中以同時向T細胞導入靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E融合基因同源重組修復模板，其中所述B2M-HLA-E融合基因的DNA序列如SEQ ID NO: 35所示，

其中所述基因編輯物質包括CRISPR-Cas9，遞送方式使用SpCas9 mRNA和修飾的sgRNA，其中靶向TRAC基因的sgRNA序列如SEQ ID NO: 4所示，靶向B2M基因的sgRNA序列如SEQ IDNO: 5所示，sgRNA的修飾方式為5’和3’端各三個堿基同時進行2’-O-甲基化和3’硫代磷酸化修飾。

2. 根據權利要求1所述的方法，所述方法還包括：

從健康受試者血中提取PBMC并激活T細胞；和/或

T細胞培養擴增，收集TCR或CD3陰性細胞。

3. 根據權利要求1所述的方法，其中SpCas9的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示, 其中SpCas9 mRNA含有入核信號。

4. 根據權利要求3所述的方法，其中所述入核信號包括SV40 NLS和核質蛋白NLS，其氨基酸序列分別為SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3。

5.根據權利要求1所述的方法，其中所述修復模版載體包括腺相關病毒、非整合型慢病毒、單鏈DNA、雙鏈DNA、質粒DNA。

6.根據權利要求5所述的方法，其中所述修復模版載體為腺相關病毒載體，其中腺相關病毒載體的血清型包括：1、2、3、4、5、6、7、8、9、DJ。

7.根據權利要求6所述的方法，其中所述血清型為血清型6。

8.根據權利要求1所述的方法，其中所述修復模版載體的核心序列從5’到3’端依次包括同源序列左臂、敲入基因、同源序列右臂。

9. 根據權利要求8所述方法，其中靶向CD19 CAR基因修復模版同源臂的長度為300-1200bp，和/或B2M-HLA-E融合基因同源臂的長度為300-1200bp。

10. 根據權利要求1所述的方法，其中敲入的基因包括以下元件或其組合：剪切肽、靶向CD19 CAR、Poly A。

11.根據權利要求10所述的方法，其中所述剪切肽是T2A、P2A或IRES。

12. 根據權利要求10所述的方法，其中所述Poly A包括BGHpA。

13. 根據權利要求10所述的方法，其中所述靶向CD19 CAR包含信號肽、靶向CD19抗體scFv、鉸鏈區、跨膜區、一個或兩個共刺激信號區、信號傳導區。

14. 根據權利要求13所述的方法，其中靶向CD19 CAR的跨膜結構選自以下蛋白：CD3、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154和PD1。

15. 根據權利要求14所述的方法，其中靶向CD19 CAR的跨膜結構選自CD8，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示。

16. 根據權利要求13所述的方法，其中靶向CD19 CAR的鉸鏈結構選自以下蛋白：IgG1、IgG4、IgD或CD8。