[發明專利]一種通用型CAR-T細胞及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201810636386.3
• 申請日: 2018-06-20
• 公開（公告）號: CN110616188B
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發明（設計）人: 楊選明;傅陽心;汪鑫;葉圣勤;張曉卿
• 申請（專利權）人: 上海隆耀生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 俞滌炯

1.一種通用型CAR-T細胞，其特征在于，所述CAR-T細胞敲除CD3Delta、CD3Gamma、CD3Epsilon和CD3?zeta；所述CAR-T細胞引入HSV-TK基因。

2.根據權利要求1所述的通用型CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：采用合適的基因敲除方法敲除CAR-T細胞CD3Delta、CD3Gamma、CD3Epsilon和CD3?zeta。

3.根據權利要求2所述的通用型CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，還包括如下步驟：對T細胞進行HSV-TK基因修飾。

4.根據權利要求2所述的通用型CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，采用基因敲除方法制備通用型CAR-T細胞具體包括如下步驟：

步驟一、慢病毒載體的構建及病毒生產；

設計針對CD3Delta、CD3Gamma、CD3?Epsilon、CD3?zeta的sgRNA，克隆到pLenti-CrisprV2，并和慢病毒包裝質粒共同轉染，預定時間后收取上清，過濾、離心濃縮病毒，制得plenti-CRISPRV2-sgRNA病毒；

步驟二、CD3陰性CAR-T細胞的制備；

將人PBMC經過分離純化后，接種到具有合適刺激條件的培養板，培養預定時間后，感染CAR病毒和步驟一生產的plenti-CRISPRV2-sgRNA病毒，按照合適的刺激條件進行細胞擴增，所得細胞去除CD3陽性細胞，獲得CD3陰性CAR-T細胞。

5.根據權利要求4所述的通用型CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，培養分離純化后的人PBMC的刺激條件為anti-hCD3和anti-hCD28，擴增細胞的刺激條件為每6天使用人工抗原呈遞細胞或anti-hCD3/28刺激。

6.根據權利要求4所述的通用型CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，所述步驟一中慢病毒包裝質粒包括VSV-g，pMD?Gag/Pol，RSV-REV；離心使用貝克曼超速離心機和SW28轉頭。

7.根據權利要求4或5所述的通用型CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，所述人PBMC為臍血或者成人外周血來源單個核細胞。

8.一種含有權利要求1所述的通用型CAR-T細胞的制劑。

9.一種如權利要求1所述的通用型CAR-T細胞在制備治療或預防腫瘤藥物中的應用。