[發明專利]一種Adgrv1基因Y6236fsX1突變動物模型的構建方法

有效

• 申請號: 201810635308.1
• 申請日: 2018-06-20
• 公開（公告）號: CN108866102B
• 公開（公告）日: 2021-11-16
• 發明（設計）人: 徐志剛;杜海波;王燕飛
• 申請（專利權）人: 山東大學深圳研究院;山東大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N9/22;A01K67/027
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

本發明公開了一種基于CRISPR/Cas9技術的Adgrv1基因Y6236fsX1突變動物模型的構建方法，步驟是(1)設計并選擇合適的靶向小鼠Adgrv1基因的Guide RNA及修復模板DNA；(2)體外合成Cas9 mRNA、Guide RNA和修復模板DNA；(3)將Guide RNA、Cas9 mRNA和修復模板DNA等摩爾比共同配制成注射樣品對受精卵注射；(4)對獲得的F0代小鼠進行鑒定；(5)陽性F0代小鼠傳代及F1代小鼠的獲得與鑒定。本方法可以成功獲得與人類中Y6244fsX1致病突變對應的Adgrv1基因Y6236fsX1突變小鼠模型，為研究人類中Y6244fsX1致病突變的相關因素和診斷治療提供了基礎。

技術領域

本發明屬于利用基因修飾技術制作基因突變動物模型技術領域，具體涉及一種基于CRISPR/Cas9技術的Adgrv1基因Y6236fsX1突變動物模型的構建方法。

背景技術

CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Shot Palindromic repeats/CRISPR-associated)系統是原核生物中一種抵抗外源基因侵入的獲得性免疫系統，在細菌和古生菌中CRISPR系統整合侵入宿主的噬菌體或者質粒DNA片段到CRISPR位點，然后通過相應的CRISPR RNAs(cr RNAs)引導Cas核酸內切酶對外源DNA序列進行切割，從而抵抗病毒或者噬菌體的入侵。CRISPR/Cas系統分為3種類型(TypeⅠ、TypeⅡ和TypeⅢ)，其中TypeⅡ系統因其簡單、高效以及功能多樣化等優點，自2013在哺乳動物細胞中成功實現基因編輯后，現已被廣泛用于多種模式生物的基因組修飾技術應用中。Ⅱ型系統可以通過crRNA的引導利用單個Cas9核酸酶對DNA靶位點進行精確充分地切割。CRISPR/Cas9系統相關載體構建簡單快速，便于操作，實驗周期較短，且廣泛適用于多個物種。在基因編輯的過程中，CRISPR/Cas9系統需要一段特殊的引導RNA，即sgRNA(single guide RNA)，sgRNA的序列選擇限制性較小，只需要基因組序列中出現PAM(NGG)區即可。在sgRNA的引導下，Cas9蛋白可以對基因組實現定點切割，引起DNA雙鏈斷裂，繼而引發細胞的自主修復，修復的過程可以是隨機的片段缺失或插入，也可以利用特定的模板修復，從而實現對基因組的永久性修飾。

Usher綜合征(Usher syndrome,USH)是一種能夠引起視覺和聽覺雙重感官障礙的遺傳性疾病，在目前已知的超過50種的視力下降合并聽力受損的綜合征中，以Usher綜合征最為常見，該病的全球發病率為1/6000～1/10000。USH為常染色體隱性遺傳病，其特征表現為視網膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)和感音神經性耳聾(sensorineuralhearing loss,SNHL)。USH在臨床上分為3種類型，都存在因視網膜色素變性而引起的進行性視力下降，區別在于聽力和前庭功能的變現各不相同。其中USH1型最為嚴重，臨床表現有先天性耳聾、嚴重的聽力損失，并因聽力障礙導致的語言發育遲緩；此類患者還經常伴有前庭功能障礙，患兒學會獨立行走的時間較同齡兒童晚。USH2型患者聽力損失較輕，為中到重度耳聾，但前庭功能正常。USH3型以漸進性聽力損失為特點，伴隨不同程度的前庭功能失調。此外，部分Usher綜合征患者還可能伴有智力衰退，嗅覺喪失，癲癇等神經系統病變。