[發明專利]CRISPR-Cas9高效敲入嵌合抗原受體基因到T細胞特定基因組位點的方法及應用

有效

• 申請號: 201810634963.5
• 申請日: 2018-06-20
• 公開（公告）號: CN110616187B
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發明（設計）人: 彭作翰;李玏
• 申請（專利權）人: 西安桑尼賽爾生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/864;C12N15/113;A61K35/17;A61P35/00;A61P35/02;A61P31/18;A61P37/02
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 關旭穎

本發明涉及CRISPR?Cas9高效敲入嵌合抗原受體基因到T細胞特定基因組位點的方法及其應用。本發明具體涉及一種將CAR基因精確敲入到T細胞目的基因組DNA的方法，所述方法包括a)采用基因編輯物質剪切目的基因組DNA，其中所述目的基因組DNA位于基因啟動子區后，起始密碼子和其所處的外顯子3端之間；b)將CAR基因克隆至修復模版載體后導入T細胞，細胞以同源重組方式修復被剪切的目的基因組DNA，從而將CAR基因嵌入，其中所述修復模版載體為腺相關病毒載體。該方法可應用于各種CAR?T細胞制備。

技術領域

本發明涉及細胞治療領域，特別涉及CRISPR-Cas9高效敲入嵌合抗原受體基因到T細胞特定基因組位點的方法及其應用。

背景技術

CAR-T治療

傳統腫瘤治療藥物包括化療藥、靶向藥，雖然它們在一定程度上提高了癌癥患者的生存期，但同時也帶來了嚴重的副作用，極大地降低了病人的生存質量。更不幸的是，大部分患者在接受這些傳統治療后仍舊會復發，而一旦復發，無藥可救是大概率事件。

近年來,隨著免疫治療的發展，免疫檢驗點抑制劑藥物(如：CTLA-4、 PD-1/PD-L1抗體)的出現，徹底改變了腫瘤治療的方式。但這類藥物在不同癌癥病人中的有效率只有20％-40％，仍然有大部分的癌癥患者等待新的有效治療方式的出現。

嵌合抗原受體T細胞(CAR-T細胞)治療技術是通過體外轉導一個識別癌細胞的人工基因于人體T細胞上，使人T細胞具有特異殺傷腫瘤細胞的能力。CAR-T細胞治療屬于過繼性免疫療法(adoptive cell transfer,ACT)，它利用人體免疫細胞來對抗腫瘤，被稱為“活體藥物”。這種ACT療法在近年已應用于臨床實驗當中，特別是在兒童白血病方面的有效探索，為研究者以及醫生開辟了一條治療腫瘤的新路徑。2017年末，兩款CAR-T藥物獲得美國FDA的許可上市，然而，這種ACT療法仍舊處于其早期階段。它與傳統藥物相比具有如下創新點：

首先，精確靶向腫瘤，且副作用可逆。CAR-T細胞治療相比化療藥、靶向藥具有更特異的腫瘤細胞殺傷能力。在輸入病人體內后，雖然短時間內會產生細胞因子效應，但該副反應可控，病人在獲得完全緩解的情況下基本上能和健康人一樣生活。

其次，持續緩解時間長。CAR-T細胞部分屬于記憶T細胞，在輸入病人體內后能長期存在于病人身體中，時刻監視身體中是否出現腫瘤細胞，一旦有新的腫瘤細胞出現就會立刻將其殺滅。

CAR轉導方式

本領域通常涉及以下CAR轉導方式：

1)慢病毒或者逆轉錄病毒

慢病毒或逆轉錄病毒可用于包裝3kb以下的目的DNA序列，其優勢在于：a.較高的感染效率，通常轉染后陽性率可以達到50％左右；b.病毒分泌到培養基中較多，濃縮純化相對容易；c.T淋巴細胞感染病毒后能保持一個良好的細胞狀態，存活和擴增不易受到影響，有利于后續回輸給病人。其不足之處在于：a.隨機插入細胞基因組中，容易導致產生的CAR-T 細胞耗竭及潛在的癌變風險；b.感染T細胞后，殘留的病毒有強免疫原性。

2)轉座子

轉座子優勢在于簡單的生產工藝流程，無病毒殘留的風險。但由于編碼轉座子的載體為質粒DNA，其在電穿孔入T細胞后有細胞毒性作用，不利于產生的CAR-T細胞擴增。同樣，轉座子介導也是隨機性地將CAR 基因插入到T細胞基因組中。

3)mRNA

mRNA編碼的CAR基因轉導T細胞依賴于電穿孔，其優勢在于只短暫地表達目的蛋白于T細胞中(大約表達7天)，對于前期不確定是否存在嚴重副作用的CAR-T細胞，這種方法能夠相對安全的進行人體實驗。但其缺點也很明顯，就是不能持久的表達，作用時間相對有限。