[發(fā)明專利]CRISPR-Cas9高效敲入嵌合抗原受體基因到T細(xì)胞特定基因組位點(diǎn)的方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810634963.5
• 申請日: 2018-06-20
• 公開（公告）號: CN110616187B
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 彭作翰;李玏
• 申請（專利權(quán)）人: 西安桑尼賽爾生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/864;C12N15/113;A61K35/17;A61P35/00;A61P35/02;A61P31/18;A61P37/02
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 11021
• 代理人: 關(guān)旭穎

1.一種將CAR基因精確敲入到T細(xì)胞目的基因組DNA的方法，所述方法包括一：

a)采用基因編輯物質(zhì)剪切目的基因組DNA，其中所述目的基因組DNA位于基因啟動(dòng)子區(qū)后，起始密碼子和其所處的外顯子3端之間；

b)將CAR基因克隆至修復(fù)模版載體后導(dǎo)入T細(xì)胞，細(xì)胞以同源重組方式修復(fù)被剪切的目的基因組DNA，從而將CAR基因嵌入，其中所述修復(fù)模版載體為腺相關(guān)病毒載體，

或二：

a)將CAR基因克隆至修復(fù)模版載體后導(dǎo)入T細(xì)胞；

b)采用基因編輯物質(zhì)剪切目的基因組DNA，其中所述目的基因組DNA位于基因啟動(dòng)子區(qū)后，起始密碼子和其所處的外顯子3端之間；

c)細(xì)胞以同源重組方式修復(fù)被剪切的目的基因組DNA，從而將CAR基因嵌入，其中所述修復(fù)模版載體為腺相關(guān)病毒載體，

其中所述CAR基因敲入目的基因組DNA位點(diǎn)為TRAC啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域，并且其中：

1)腺相關(guān)病毒載體包含的左右同源臂分別為：i)1170bp的同源臂，其中左臂包含序列SEQ ID NO:12，右臂包含序列SEQ ID NO:13；ii)600bp的同源臂，其中左臂包含序列SEQ IDNO:14，右臂包含序列SEQ ID NO:15；或iii)300bp的同源臂，其中左臂包含序列SEQ ID NO:16，右臂包含序列SEQ ID NO:17；所述CAR基因包括靶向CD19 CAR，其序列如SEQ ID NO:18所示；

2)所述基因敲入到TRAC基因外顯子1的5’端區(qū)域；和

3)采用Cas9 mRNA和修飾的sgRNA剪切TRAC基因，其中所述修飾的sgRNA如序列SEQ IDNO:19所示，并且所述sgRNA頭尾三個(gè)堿基用甲基化和/或硫代磷酸化修飾。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中敲入的基因從5’端到3’端包括：剪切肽基因、CAR基因、Poly A基因。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中剪切肽是T2A、P2A和IRES，其DNA序列分別如SEQ IDNO:2-4所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中Poly A包括BGHpA，其DNA序列如SEQ ID NO:5所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中CAR基因包含信號肽DNA、抗體scFv DNA、鉸鏈區(qū)DNA、跨膜區(qū)DNA、一個(gè)或兩個(gè)共刺激信號區(qū)DNA和信號傳導(dǎo)區(qū)DNA。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中CAR的跨膜結(jié)構(gòu)選自CD8，其氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中CAR的鉸鏈結(jié)構(gòu)選自CD8，其氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中CAR的共刺激信號選自CD137，其氨基酸序列如SEQID NO:8所示。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中CAR的信號傳導(dǎo)區(qū)選自CD3ζ，其氨基酸序列如SEQID NO:10所示。

10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中CAR信號肽選自CD8，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。

11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述腺相關(guān)病毒載體的血清型包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、DJ。

12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法制備的CAR-T細(xì)胞在制備藥物中的用途，其中所述藥物用于治療白血病、實(shí)體腫瘤或免疫疾病。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，所述免疫疾病為艾滋病。