[發明專利]一種靶向外泌體進行基因載藥的載體及其構建方法及應用

有效

• 申請號: 201810633775.0
• 申請日: 2018-06-20
• 公開（公告）號: CN108753827B
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發明（設計）人: 唐凡;吳小江;顧莉萍;余虹
• 申請（專利權）人: 上海生博生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;A61K48/00
• 代理公司: 上海市匯業律師事務所 31325
• 代理人: 唐嘉偉

本發明公開了一種靶向外泌體進行基因載藥的載體，包括CMV7啟動子、選擇性的標記Puromycin、抗性基因；在所述CMV7啟動子和選擇性的標記Puromycin之間的多克隆位點處加上如SEQ ID NO.1所示的EGFP?F5/8 typeC序列。此外，本發明還公開了該載體的構建方法和應用。本發明載體使得外泌體能夠最大限度攜帶外源基因，進行基因藥物的遞送。本發明載體的基因序列較小，能夠增加攜帶基因的容量，拓寬了外源基因的選擇余地。本發明載體的熒光效果更強，能夠明顯且直觀的觀察。

技術領域

本發明屬于基因工程和生物技術領域，尤其涉及一種載體，具體涉及一種靶向外泌體進行基因載藥的載體；此外，本發明還涉及該載體的構建方法和應用。

背景技術

外泌體是細胞分泌的細胞外囊泡，人體幾乎所有細胞均可產生外泌體，如B細胞，T細胞，血細胞、腫瘤細胞等，且外泌體存在于所有的體液中，如尿液、血液、腦脊液等。外泌體直徑大約在30nm到100nm之間。外泌體其主要來源于細胞內內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體，經多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質中。

外泌體包含的各種物質均來源于其細胞，如蛋白質，RNA，雙鏈DNA，代謝分子。由于外泌體的體積非常小，這點優勢使得他們可以逃避機體內的單核吞噬細胞系統的吞噬作用，并且可以穿過血管內皮細胞，到達下游的目的細胞。另外，還有研究發現外泌體甚至可以通過血腦屏障、胎盤屏障等。此外，外泌體具有生物來源的特點，使得其免疫原性比較低。外泌體可通過和其他細胞的細胞膜進行融合，發生內吞，從而將外泌體的內容物釋放到下游細胞中來發揮作用，也可以通過細胞膜表面受體相互作用與靶細胞進行交流，將內含物釋放至靶細胞中，運用此類方法，可以減少基因藥物的降解，逃避溶酶體途徑。

傳統的藥物遞送載體有病毒載體，納米材料等。病毒載體雖然已有作為基因藥物的運載工具，且有臨床試驗成功的先例，然而由于病毒載體會整合至整個基因組中以及突變回野生型病毒的風險存在，使得病毒載體在應用受到限制。納米材料如脂質體，納米顆粒等越來越多的應用于藥物遞送系統中，但是仍然存在生物相容性低，穩定性差等缺點，因此，外泌體作為一種細胞分泌的囊泡，是作為基因藥物遞送載體的最佳選擇。

存在的問題：目前，選用最多的是將外泌體的標志物即四跨膜蛋白CD63，CD81，CD9作為引導，將其他目的基因或者熒光蛋白，與標志物蛋白進行融合表達，從而將表達的外源基因引導帶至外泌體中。然而，運用類似此類標志物有以下幾個弊端：第一就是自身基因較大，受載體限制，使得外源基因的選擇余地比較小；其次，此類標志物蛋白靶向性比較差，在細胞器膜上，同樣也富含此類蛋白，所以導致轉化率比較小，效率較低。另外，CD63，CD9，CD81被視為細胞功能的重要蛋白，利用此類蛋白做引導，勢必會影響細胞或者是外泌體的功能。

因此，開發能夠有效且有特異性，且不影響細胞、外泌體功能的具有靶向外泌體的載體就成為需要迫切解決的一個技術問題。

發明內容

本發明要解決的技術問題之一是提供一種可以靶向外泌體進行基因載藥的載體，通過使用分泌蛋白Retinoschisin的F5/8 typeC的區域，即Retinoschisin基因的第59-244氨基酸，能夠使得連接的蛋白質能夠特異引導到細胞外囊泡的膜上，從而使外源的基因物能夠包裹進外泌體中，由于使用的是肽段，使得外泌體能夠最大限度攜帶外源基因，進行基因藥物的遞送。

本發明要解決的技術問題之二是提供該載體的構建方法。

本發明要解決的技術問題之三是提供該載體的應用。

為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：