[發明專利]一種靶向外泌體進行基因載藥的載體及其構建方法及應用

有效

• 申請號: 201810633775.0
• 申請日: 2018-06-20
• 公開（公告）號: CN108753827B
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發明（設計）人: 唐凡;吳小江;顧莉萍;余虹
• 申請（專利權）人: 上海生博生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;A61K48/00
• 代理公司: 上海市匯業律師事務所 31325
• 代理人: 唐嘉偉

1.一種靶向外泌體進行基因載藥的載體，其特征在于，包括CMV7啟動子、選擇性的標記Puromycin、抗性基因以及病毒載體骨架PLVX-CMV7-MCS-EF1-Puro；在所述CMV7啟動子和選擇性的標記Puromycin 之間的多克隆位點處加上如SEQ ID NO.1所示的EGFP-F5/8 typeC序列。

2.如權利要求1所述的載體，其特征在于，所述抗性基因為氨芐青霉素抗性基因。

3.如權利要求1所述的載體，其特征在于，所述載體還包括多克隆位點MCS，該多克隆位點MCS用于插入熒光或其他蛋白質、靶向小分子。

4.如權利要求1-3任一項所述的載體的構建方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

第一步，合成目的基因Retinoschisin的F5/8 typeC的區域，即Retinoschisin基因編碼的第59-244氨基酸；第一步具體為：（1）根據GenBank中人MFGE8的mRNA上CDS序列、人RS1的mRNA上CDS序列、EGFP標簽蛋白序列、linker標簽序列的基因信息，設計EcoRI-MFGE8-EGFP-linker-RS1-XhoI基因DNA片段，合成如SEQ ID NO.1所示的雙鏈DNA分子；所述EcoRI-MFGE8- EGFP-linker-RS1-XhoI基因DNA片段中，MFGE8為MFGE8基因編碼的第1-23氨基酸，RS1為RS1基因編碼的第59-224氨基酸；

（2）分別用合成的引物，如SEQ ID NO.2所示的PSE2705-F和如SEQ ID NO.3所示的PSE2705-R來PCR步驟（1）合成的雙鏈DNA分子，得到PCR產物；

第二步，將該基因構建至病毒載體PLVX-CMV7-MCS-EF1-Puro中。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，第二步具體為：

1）用限制性內切酶EcoRI和XhoI酶切病毒載體PLVX -CMV7-MCS-EF1-Puro，回收載體骨架；

2）將步驟(2)的PCR產物和步驟1)的載體骨架重組，轉化進大腸桿菌，篩選陽性菌并提取其質粒，得到重組載體。

6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟（2）中，所述PCR 的體系按照32.5μl H₂O，10μl 5×Buffer 含有Mg²⁺的緩沖液，4μl dNTP，1μl 正向引物Primer1，1μl 反向引物Primer2，1μl 目的基因模板DNA，以及0.5μl 的PrimeSTAR酶，組成反應體系；

所述PCR程序如下：98℃，變性3分鐘；退火98℃10秒，55℃15秒，72℃1分鐘，重復30個循環；延伸72℃ 10分鐘。

7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟1）中，所述酶切體系為： EcoRI:1μL，XhoI:1μL，緩沖液:3μL，PLVX -CMV7-MCS-EF1-Puro質粒:1μg，補充水至30μL；37℃酶切4小時。

8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2）中，所述重組體系為：重組酶:15μL，回收的PCR產物DNA:40ng，回收的質粒:20ng；42℃水浴30min后，轉化進大腸桿菌。

9.一種如權利要求1-3任一項所述的載體在制備靶向外泌體進行基因藥物遞送的產品中的應用。