[發(fā)明專利]一種檢測(cè)蛋白純度的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810633150.4
• 申請(qǐng)日: 2018-06-20
• 公開（公告）號(hào): CN110618202B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柯瀟;岳菊;鄭強(qiáng);雷剛;白灝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 成都康弘生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06
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• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明提供了一種蛋白純度的檢測(cè)方法，采用體積排阻?高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，以磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相可用于蛋白類生物制品中二聚體雜質(zhì)的含量測(cè)定。本發(fā)明的蛋白純度檢測(cè)方法可以很好的將二聚體蛋白與單體蛋白分離開來，具有快速、簡(jiǎn)便、檢測(cè)限低，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適于產(chǎn)業(yè)應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)蛋白純度的方法。

背景技術(shù)

隨著生物技術(shù)與制藥工業(yè)的迅猛發(fā)展，越來越多的蛋白和多肽類藥物被研發(fā)并應(yīng)用于臨床。抗體和融合蛋白都是常見的蛋白類藥物，這些藥物蛋白大多由CHO細(xì)胞表達(dá)，糖基化程度高，在細(xì)胞培養(yǎng)和純化生產(chǎn)工藝流程中會(huì)聚集產(chǎn)生多聚體，另外，蛋白類藥物保存條件、自身穩(wěn)定性對(duì)多聚體的產(chǎn)生也有著不同程度的影響。蛋白聚集對(duì)于蛋白藥物的安全性和有效性有著極大的影響，二聚體蛋白質(zhì)可能由于較大的分子量二影響其穿膜特性，導(dǎo)致生物利用度降低，抗體蛋白的聚集還可能產(chǎn)生免疫源性，給藥后將給患者帶來潛在風(fēng)險(xiǎn)，因此蛋白純度檢測(cè)成為蛋白質(zhì)藥物質(zhì)量控制的重要指標(biāo)之一。

目前檢測(cè)蛋白藥物純度有兩種常用的方法，一種是非還原蛋白質(zhì)電泳，另一種是體積排阻色譜法(SEC)。非還原蛋白質(zhì)電泳需要在變性條件下操作，可能會(huì)影響多聚體成分的含量，而SEC是利用多孔凝膠固定相的獨(dú)特特性，而產(chǎn)生的一種主要依據(jù)分子尺寸大小的差異來進(jìn)行分離的方法，其檢測(cè)條件比較溫和，不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的天然形態(tài)產(chǎn)生大的影響。因此，SEC方法更適應(yīng)產(chǎn)業(yè)上進(jìn)行產(chǎn)品的質(zhì)量控制。但目前公開的體積排阻色譜方法用于檢測(cè)蛋白中二聚體雜質(zhì)時(shí)，常出現(xiàn)分離度差或無法分離二聚體雜質(zhì)的問題，且某些方法穩(wěn)定性較差，檢測(cè)靈敏度較低，不適于低濃度二聚體雜質(zhì)的分離檢測(cè)。

為了進(jìn)一步保障蛋白藥物的質(zhì)量安全，有必要建立一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏、穩(wěn)定的體積排阻色譜檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、穩(wěn)定性好的檢測(cè)方法，用于二聚體蛋白雜質(zhì)的分離檢測(cè)。本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種檢測(cè)蛋白純度的方法，采用體積排阻-高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，所述檢測(cè)方法的色譜條件中流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液；其中，所述磷酸鹽緩沖液為包含150mM PB和100mMNaCl的水溶液；所述蛋白選自抗體或融合蛋白，優(yōu)選的，所述抗體包含SEQ ID NO：2所示的輕鏈序列和SEQ ID NO：3所示的重鏈序列；所述融合蛋白包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

本發(fā)明所述檢測(cè)蛋白純度方法的色譜條件中，流動(dòng)相的pH在6.5-7.0均能實(shí)現(xiàn)較好的檢測(cè)效果，優(yōu)選為7.0。

進(jìn)一步，本發(fā)明檢測(cè)方法的色譜條件中，檢測(cè)波長(zhǎng)優(yōu)選為220nm，色譜柱優(yōu)選為TSK-GEL G3000 SWXL型凝膠排阻色譜柱，流動(dòng)相流速優(yōu)選為0.5mL/min，柱溫為20-30℃，優(yōu)選25℃。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種檢測(cè)蛋白純度的方法，包含以下步驟：

1)流動(dòng)相配置：稱取磷酸二氫鈉適量溶解于超純水中得磷酸二氫鈉溶液，稱取磷酸氫二鈉適量溶解于超純水中得磷酸氫二鈉溶液；取適量磷酸二氫鈉溶液和磷酸氫二鈉溶液混勻，再加入NaCl，溶解后用酸堿調(diào)節(jié)劑調(diào)pH值至6.5-7.0，微孔濾膜過濾，即得；其中，所述酸堿調(diào)節(jié)劑選自氫氧化鈉、鹽酸；

2)供試品溶液配置：取待測(cè)蛋白樣品適量，加入緩沖液，混勻，即得；

3)色譜檢測(cè)：采用高效液相色譜法，凝膠體積排阻色譜柱，使用步驟1)中配置的流動(dòng)相溶液，柱溫25℃，流速為0.5mL/min，波長(zhǎng)220nm，將步驟2)制備的供試品注入高效液相色譜儀，進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明人在長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，色譜檢測(cè)條件對(duì)于體積排阻-高效液相色譜法(SEC-HPLC)檢測(cè)蛋白中二聚體的效果有顯著影響，以下是部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。

1、實(shí)驗(yàn)材料

本發(fā)明所用實(shí)驗(yàn)材料如下：