[發(fā)明專利]遞送融合型RNA結合蛋白的表達載體及其制備方法和應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810632885.5
• 申請日: 2018-06-20
• 公開（公告）號: CN108753822A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發(fā)明（設計）人: 袁麗君;李者龍;楊國棟;周雪瑩;趙聯璧
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/62;C12N15/66;C12N5/10;A61K47/46
• 代理公司: 鄭州浩翔專利代理事務所(特殊普通合伙) 41149
• 代理人: 靳錦;邊延松

本發(fā)明公開了一種遞送融合型RNA結合蛋白的表達載體，包括引導蛋白序列和RNA結合蛋白序列；引導蛋白為能夠定位于外泌體和/或溶酶體的引導蛋白；RNA結合蛋白序列包括RNA結合蛋白全序列或RNA結合蛋白結構域序列。并提供一種所述載體的制備方法。還設計一種含所述的遞送融合型RNA結合蛋白的表達載體的外泌體，其制備方法為：將所述載體與包裝質粒一起共轉染HEK293T細胞包裝病毒，隨后將病毒感染外泌體包裝細胞，收集外泌體即得。將上述表達載體或外泌體在藥物遞送載體和RNA調控的相關疾病治療中應用。本發(fā)明選取外泌體作為遞送RNA結合蛋白的手段，創(chuàng)建了一種高效的遞送改造的融合型RNA結合蛋白的方法。

技術領域

本發(fā)明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種遞送融合型RNA結合蛋白的表達載體及其制備方法和應用。

背景技術

蛋白類藥物在醫(yī)藥領域中的比重越來越大，靶向遞送蛋白類藥物，特別是在組織和細胞類的蛋白藥物，是整個蛋白類藥物應用最為重要的環(huán)節(jié)。

目前，蛋白類藥物的遞送手段包括：通過蛋白融合穿膜肽解決跨細胞遞送的問題，利用微球或水凝膠解決蛋白質緩釋的問題，通過靶向型納米顆粒或納米凝膠解決組織和細胞靶向性問題。然而，這些手段機制復雜，不易調控。

近年來，外泌體作為細胞間蛋白和核酸信息分子傳遞的手段，得到越來越多的重視。外泌體是指包含了復雜RNA和蛋白質的小膜泡，其主要來源于細胞內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體，經多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質中。然而，但如何利用外泌體干預內源蛋白，目前缺乏理想策略。

RNA結合蛋白通過轉錄后調控方式調節(jié)基因表達，其中有相當比例通過增加mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率，促進基因表達，在多種疾病中扮演重要角色。這類RNA結合蛋白是理想的藥物靶點，但遞送手段和干預手段非常有限，如何靶向干預其功能成為瓶頸問題。

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種遞送融合型RNA結合蛋白的表達載體及其制備方法和應用。

為解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案：

設計一種遞送融合型RNA結合蛋白的表達載體，所述表達載體包括融合蛋白序列和RNA結合蛋白序列；所述融合蛋白為能夠定位于外泌體和/或溶酶體的引導蛋白；所述RNA結合蛋白序列包括RNA結合蛋白全序列或RNA結合蛋白結構域序列。

優(yōu)選的，所述融合蛋白為溶酶體相關膜蛋白。

優(yōu)選的，所述RNA結合蛋白為人抗原R(HuR)。

提供一種所述遞送融合型RNA結合蛋白的表達載體的制備方法，包括以下步驟：

(1)Trizol提取小鼠成纖維細胞總RNA；

(2)利用Promega M-MLV反轉錄酶對RNA進行反轉錄得小鼠成纖維細胞cDNA；

(3)以反轉錄cDNA為模板，擴增融合蛋白和RNA結合蛋白目的條帶；

(4)將目的條帶用限制性內切酶酶切連入表達載體，即得。

設計一種含所述的遞送融合型RNA結合蛋白的表達載體的外泌體，其制備方法為：將所述載體與包裝質粒一起共轉染HEK293T細胞包裝病毒，即得能夠產生該融合蛋白的病毒；將該病毒感染外泌體包裝細胞，如間充質干細胞MSCs,收集感染細胞分泌的外泌體，即可獲得目標外泌體。

優(yōu)選的，所述包裝質粒為psPAX2和/或pMD2.G。

將上述表達載體或外泌體在藥物遞送載體中應用。

將上述表達載體或外泌體在RNA調控的相關疾病治療中應用。

與現有技術相比，本發(fā)明的有益技術效果在于：