[發(fā)明專利]白木香毛狀根誘導(dǎo)及其遺傳轉(zhuǎn)化方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810631680.5
• 申請(qǐng)日: 2018-06-19
• 公開（公告）號(hào): CN108841856B
• 公開（公告）日: 2022-02-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏建和;隋春;徐嬌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;A01H5/06;A01H4/00
• 代理公司: 廣州獨(dú)角熊知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 44580
• 代理人: 張小黎

本發(fā)明提供了一種白木香毛狀根誘導(dǎo)及其遺傳轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明基于對(duì)外殖體類型、侵染方式、侵染時(shí)間、毛狀根培養(yǎng)溫度等條件的摸索，試驗(yàn)篩選出適合白木香毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)的條件，得到適合白木香不同外殖體最適侵染條件。并給出了SW101誘導(dǎo)白木香不同部位(子葉、莖段、根段、葉片)產(chǎn)生毛狀根的最佳誘導(dǎo)條件。本發(fā)明提供了的白木香毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，通過將綠色熒光蛋白基因(gfp)導(dǎo)入到了白木香毛狀根中，直觀的鑒別白木香毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化是否成功，同時(shí)結(jié)合PCR檢測(cè)的方式雙重驗(yàn)證轉(zhuǎn)化體系的有效性。為白木香功能基因研究和/或白木香毛狀根代謝產(chǎn)物的產(chǎn)業(yè)化提供了更好、更高效、更簡(jiǎn)便的選擇。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種白木香毛狀根誘導(dǎo)及其遺傳轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)

毛狀根，又稱發(fā)狀根，發(fā)根，是由發(fā)根農(nóng)桿菌含有的Ri質(zhì)粒上的T-DNA插入到植株或器官、組織(包括愈傷組織)、單個(gè)細(xì)胞、原生質(zhì)體的細(xì)胞核基因組，而在感染部位產(chǎn)生的大量副產(chǎn)物。毛狀根的誘導(dǎo)培養(yǎng)可作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)有應(yīng)用價(jià)值的植物代謝產(chǎn)物。另外，還可通過發(fā)根農(nóng)桿菌將外源基因?qū)耄哉{(diào)控目標(biāo)代謝產(chǎn)物的合成。

沉香是瑞香科沉香屬(Aquilaria spp.)和擬沉香屬(Gyrinops spp.)植物的樹干或樹根在受到各種傷害后引發(fā)自我防御反應(yīng)的過程中，分泌特殊油脂等而形成。沉香屬和擬沉香屬物種均已列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》(CITES)附錄II。白木香Aquilaria sinensis是我國(guó)特有的產(chǎn)沉香的植物。

目前可見有白木香不定根和離體側(cè)根的培養(yǎng)報(bào)道，(1、《MeJA誘導(dǎo)白木香不定根產(chǎn)生倍半萜類物質(zhì)的研究》蔣研風(fēng)羊廣州中醫(yī)藥大學(xué)2015-06-01碩士畢業(yè)論文。2、白木香離體側(cè)根中色酮類化合物的誘導(dǎo)形成，中草藥第41卷第2期2010年2月，281-284。)還未見有白木香毛狀根誘導(dǎo)及其遺傳轉(zhuǎn)化的研究報(bào)道，也還未見有白木香遺傳轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)基因)的研究報(bào)道。

本發(fā)明的目的在于建立白木香毛狀根誘導(dǎo)體系，利用這一體系將外源基因?qū)氚啄鞠忝珷罡?。結(jié)合對(duì)毛狀根進(jìn)行機(jī)械傷害或化學(xué)處理等手段，這一技術(shù)可應(yīng)用于生產(chǎn)沉香特異成分，也可轉(zhuǎn)化不同基因，用于白木香形成沉香的機(jī)理研究。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供一種白木香毛狀根誘導(dǎo)及其遺傳轉(zhuǎn)化方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明第一方面提供了一種白木香毛狀根誘導(dǎo)方法，包括如下步驟：

(1)獲得用于侵染的外殖體；

(2)獲得供侵染用的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液；

(3)轉(zhuǎn)化外殖體進(jìn)行共培養(yǎng)：將步驟1)所得的外殖體置于步驟2)所得侵染用的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，搖培浸染；然后轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基。

(4)毛狀根的誘導(dǎo)：取步驟(3)處理的外殖體置于抑菌培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)發(fā)根，獲得誘導(dǎo)的毛狀根。

在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(1)中，所述的獲得用于侵染的外殖體的步驟具體包括：將消毒種子培養(yǎng)至萌芽，得無菌幼苗，取子葉、莖段、根段和葉片，即獲得所述用于侵染的外殖體。

在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，種子消毒后接種于MS固體培養(yǎng)基中，25℃，8h光照/16h黑暗條件下培養(yǎng)7～10天，獲得無菌幼苗。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，除本發(fā)明實(shí)施例所示示例之外，還可以采用其他的方法對(duì)種子進(jìn)行消毒、除菌，并培養(yǎng)至種子萌芽，獲得無菌幼苗。

進(jìn)一步地，所述獲得的白木香無菌幼苗的子葉、莖段、根段和葉片置于無激素MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)1～3天后，獲得用于侵染的外殖體；優(yōu)選地，預(yù)培養(yǎng)1、2或3天。

更進(jìn)一步地，所述消毒除菌的方法包括：采用75％的酒精浸泡30～50S，20％的次氯酸鈉(NaClO)溶液封閉處理5-20min，無菌水沖洗3～5次。