[發明專利]白木香毛狀根誘導及其遺傳轉化方法

有效

• 申請號: 201810631680.5
• 申請日: 2018-06-19
• 公開（公告）號: CN108841856B
• 公開（公告）日: 2022-02-08
• 發明（設計）人: 魏建和;隋春;徐嬌
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院藥用植物研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/06;A01H4/00
• 代理公司: 廣州獨角熊知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 44580
• 代理人: 張小黎

1.一種白木香毛狀根誘導的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)獲得用于侵染的外殖體；

(2)獲得供侵染用的發根農桿菌菌液；

(3)轉化外殖體進行共培養：將步驟(1)所得的外殖體置于步驟(2)所得侵染用的發根農桿菌菌液中，搖培浸染；然后轉入MS培養基；

其中，當外殖體為子葉、葉片及莖段時，步驟(3)中所述的共培養包括：將上述步驟(1)所得的外殖體于MS+200μM AS固體培養基上預培養1～3d，然后置于步驟(2)所得的發根農桿菌菌液中28℃，180rpm侵染5～30min，然后轉入MS+rif固體共培養基上培養2～5d；或者當外殖體為子葉與根時，步驟(3)中所述的共培養包括：將上述步驟(1)所得的外殖體置于步驟(2)所得的發根農桿菌菌液中，超聲處理5-30min，然后轉入MS+rif固體共培養基上培養2～5d；或者當外殖體為根時，步驟(3)中所述的共培養包括：將上述步驟(1)所得的外殖體置于步驟(2)所得的發根農桿菌菌液中，超聲處理5～30sec，再30～50℃處理2～8min，20～30℃10～30min，然后置于固體MS+rif固體共培養基上共培養2～5d；

(4)毛狀根的誘導：取步驟(3)處理的外殖體置于抑菌MS培養基中，25℃～30℃黑暗培養，誘導發根，20-30d后選擇長勢良好的根系分別繼代，共抑菌處理90-100d，置于MS液體培養基，150rpm，25℃～30℃黑暗培養，獲得誘導的毛狀根。

2.如權利要求1所述的白木香毛狀根誘導的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述菌液OD值為0.8～1.2。

3.如權利要求1所述的白木香毛狀根誘導的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所用菌株為發根農桿菌A4、ACCC10060、ATCC15834中的一種或多種。

4.一種白木香毛狀根的遺傳轉化方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)獲得用于侵染的外殖體；

(2)獲得供侵染用的發根農桿菌菌液，所述發根農桿菌包含插入有外源基因的載體；

(3)轉化外殖體進行共培養：將步驟(1)所得的外殖體置于步驟(2)所得侵染用的發根農桿菌菌液中，搖培浸染；然后轉入MS培養基；

其中，當外殖體為子葉、葉片及莖段時，所述步驟(3)中包括以下步驟：將上述步驟(1)所得的外殖體于MS+200μM AS固體培養基上預培養1～3d，然后置于步驟(2)所得的發根農桿菌菌液中28℃，180rpm侵染5～30min，然后轉入MS+rif固體共培養基上培養2～5d；或者當外殖體為子葉與根時，所述步驟(3)中包括以下步驟：將上述步驟(1)所得的外殖體置于步驟(2)所得的發根農桿菌菌液中，超聲處理5-30min，然后轉入MS+rif固體共培養基上培養2～5d；或者當外殖體為根時，所述步驟(3)中包括以下步驟：將上述步驟(1)所得的外殖體置于步驟(2)所得的發根農桿菌菌液中，超聲處理5～30sec，再30～50℃處理2～8min，20～30℃10～30min，然后置于固體MS+rif固體共培養基上共培養2～5d；

(4)毛狀根的誘導：取步驟(3)處理的外殖體置于抑菌MS培養基中，25℃～30℃黑暗培養，誘導發根，20-30d后選擇長勢良好的根系分別繼代，共抑菌處理90-100d，置于MS液體培養基，150rpm，25℃～30℃黑暗培養，獲得誘導的毛狀根。

5.如權利要求4所述的白木香毛狀根的遺傳轉化方法，其特征在于，所述插入有外源基因的載體為PK7WG2D載體、pBI121載體、pCAMBIA系列載體中的一種或多種。

6.一種如權利要求1所述的白木香毛狀根誘導方法在白木香毛狀根誘導、遺傳轉化、基因功能研究和/或白木香代謝產物生產中的應用。

7.一種如權利要求4所述的白木香毛狀根的遺傳轉化方法在白木香毛狀根誘導、遺傳轉化、基因功能研究和/或白木香代謝產物生產中的應用。