[發明專利]一種幼年大鼠視網膜色素上皮細胞分離培養方法

在審

• 申請號: 201810622406.1
• 申請日: 2018-06-15
• 公開（公告）號: CN108998413A
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發明（設計）人: 婁慧;徐國旭;解來青;孫亮;荊劍
• 申請（專利權）人: 蘇州大學附屬第二醫院
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

本發明公開了一種幼年大鼠視網膜色素上皮細胞分離培養方法；包括以下步驟:(1)取大鼠眼球用0.02mg/mL Dispase酶消化處理；(2)解剖眼球，去除角膜、晶體和脈絡膜組織，分離視網膜，并剪成視網膜片，將視網膜片放入培養箱中孵育，孵育結束后，使視網膜片在培養皿內流動，促進視網膜上皮細胞片與視網膜片分離；(3)吸取分離后的視網膜上皮細胞片，在含PBS的培養皿中清洗；(4)清洗后的視網膜上皮細胞片轉移到新的含PBS的培養皿中，加入胰酶消化、吹打，再種植于細胞培養皿中，置于37℃，5％CO₂培養箱中培養。與現有技術相比，本發明方法具有無雜細胞污染，無需人為機械分離操作，過程簡易，分離時間短的特點。

技術領域

本發明涉及細胞分離培養技術領域，尤其是一種幼年大鼠視網膜色素上皮細胞分離培養方法。

背景技術

視網膜色素上皮細胞(RPE細胞)是視網膜外部的單層細胞，因其多邊形形態和胞質內豐富的黑色素而得名，它們在視網膜細胞的維持和自我更新上發揮重要的功能，如：吞噬消化脫落的光感受器細胞外節盤膜；促進視循環中11-順視黃醛的再生；分泌神經營養因子；參與形成視網膜-血管屏障等。RPE細胞的這些生理功能異常被認為與相關眼科疾病的發生密切相關，如年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)和萊伯氏先天性黑蒙癥(Leber congenital amaurosis,LCA)等。

RPE細胞具有極性，其基底膜與Bruch膜相連構成Bruch膜內層，其頂部微絨毛和感光細胞外節相連。在成年大鼠中RPE細胞基底面和Bruch膜連接緊密，RPE細胞微絨毛和感光細胞外節連接緊密，這些都使得RPE細胞的分離變得困難。由于新生大鼠(出生后2周內)感光細胞外節還未發育完全，其與RPE細胞易于分離。因此大多數方法均選擇在這一時間段內，但也有成年大鼠的RPE細胞分離方法的報導。目前已有報導使用木瓜蛋白酶(papain)、膠原酶(collagenase)和Dispase分散酶等多種方法分離新生大鼠的RPE細胞。這些已有的從新生大鼠中分離RPE細胞的方法均采用機械方法將RPE細胞從視網膜上剝離，操作所需時間長，難度大，并且容易造成視網膜相關細胞污染。

此外，這些方法使用的均是色素大鼠，由于其RPE細胞含黑色素，便于機械分離時識別RPE細胞和視網膜。對于白化大鼠而言這些方法的局限更加明顯，由于白化大鼠的RPE細胞不含色素，難于與視網膜區分開來，目前還沒有分離新生白鼠RPE細胞的報導。

發明內容

本發明針對已有方法的不足，進而提供一種幼年大鼠視網膜色素上皮細胞分離培養方法。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

一種幼年大鼠視網膜色素上皮細胞分離培養方法，包括以下步驟:

(1)取大鼠眼球用0.02mg/mL Dispase酶消化處理；

(2)解剖眼球，去除角膜、晶體和脈絡膜組織，分離視網膜，并剪成視網膜片，將視網膜片放入培養箱中孵育，孵育結束后，輕輕搖培養皿使視網膜片在培養皿內流動，促進視網膜上皮細胞片與視網膜片分離；

(3)吸取分離后的視網膜上皮細胞片，清洗；

(4)清洗后的視網膜上皮細胞片轉移到新的含PBS的培養皿中，加入胰酶消化、吹打，再種植于細胞培養皿中，置于37℃，5％CO₂培養箱中培養。

在本發明的一個實施方式中，步驟(1)所述大鼠為白化大鼠，視網膜色素上皮細胞無色素。需要說明的是本發明的方法也同樣適用于色素大鼠，只是對于難以用常規方法處理的白化大鼠更為適用。

在本發明的一個實施方式中，步驟(1)所述大鼠為新生10天大鼠。

在本發明的一個實施方式中，將大鼠脫頸處死，無菌條件下取出眼球。