[發(fā)明專利]一種幼年大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810622406.1
• 申請(qǐng)日: 2018-06-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108998413A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-12-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 婁慧;徐國(guó)旭;解來(lái)青;孫亮;荊劍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/079
• 分類號(hào): C12N5/079
• 代理公司: 上海科盛知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

1.一種幼年大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)取大鼠眼球用0.02mg/ml Dispase酶消化處理；

(2)解剖眼球，去除角膜、晶體和脈絡(luò)膜組織，分離視網(wǎng)膜，并剪成視網(wǎng)膜片，將視網(wǎng)膜片放入培養(yǎng)箱中孵育，孵育結(jié)束后，使視網(wǎng)膜片在培養(yǎng)皿內(nèi)流動(dòng)，促進(jìn)視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞片與視網(wǎng)膜片分離；

(3)吸取分離后的視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞片，在含PBS的培養(yǎng)皿中清洗；

(4)清洗后的視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞片轉(zhuǎn)移到新的含PBS的培養(yǎng)皿中，加入胰酶消化、吹打，再種植于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種幼年大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)所述大鼠為白化大鼠。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種幼年大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)所述大鼠為新生10天大鼠。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種幼年大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)中，大鼠眼球先用含100U/mL青霉素與100mg/mL鏈霉素的PBS沖洗，再用0.02mg/ml Dispase酶消化。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種幼年大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)中，解剖眼球是在含10v/v％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中進(jìn)行。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種幼年大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)中，剪成視網(wǎng)膜片是采用以下方法進(jìn)行的：用顯微眼科剪刀直接剪成小片。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種幼年大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)中，視網(wǎng)膜片放入培養(yǎng)箱中孵育的條件是：37℃培養(yǎng)箱中孵育20～30分鐘。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種幼年大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)中，使視網(wǎng)膜片在培養(yǎng)皿內(nèi)流動(dòng)的方法是：按順時(shí)針或逆時(shí)針?lè)较蜉p輕搖培養(yǎng)皿使視網(wǎng)膜片在培養(yǎng)皿內(nèi)流動(dòng)。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種幼年大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(4)中，加入胰酶消化的條件是：用0.25％胰酶37℃消化1～2分鐘。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種幼年大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(4)完成后，每2天更換一次培養(yǎng)基。