[發明專利]制備免疫缺陷的大鼠的方法及其應用

有效

• 申請號: 201810621840.8
• 申請日: 2018-06-15
• 公開（公告）號: CN109136273B
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發明（設計）人: 惠利健;張魯狄
• 申請（專利權）人: 中國科學院分子細胞科學卓越創新中心
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N9/22;A01K67/027;C12N15/113
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發明涉及制備免疫缺陷的大鼠的方法及其應用。本發明人利用新的方法，構建獲得了新型的免疫缺陷大鼠。應用所述的免疫缺陷大鼠，本發明人進一步建立了肝細胞、腫瘤細胞等細胞移植模型。本發明的免疫缺陷大鼠具有良好的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物學領域，更具體地，本發明涉及制備免疫缺陷的大鼠的方法及其應用。

背景技術

肝臟疾病是威脅人類健康的重要疾病之一，尤其是肝炎病毒引發的肝炎、肝硬化和肝癌以及瘧原蟲導致的瘧疾影響人類健康并造成嚴重經濟負擔。肝臟疾病的發病機制及治療極其復雜，而且人肝細胞體外培養后迅速失去肝特性。因此除了細胞水平，更需要借助動物模型從機體水平進行相關研究。但嗜肝性病原體具有高度的宿主特異性，只能感染人和少數高等靈長類動物(如黑猩猩等)的肝細胞，導致無法在小鼠等傳統動物模型中進行相關肝臟疾病研究。通過人肝細胞移植后重構免疫缺陷動物肝臟，可以建立肝臟人源化動物。一種肝臟人源化動物構建方法為：首先從肝臟供體中分離原代肝細胞，然后移植到帶有肝損傷的免疫缺陷動物模型(如uPA-SCID小鼠)中。經過6-8周再殖，人肝細胞重構了小鼠肝臟。根據血清中人血清白蛋白的分泌量，確定整合比例高的人源化小鼠，用于后續藥物代謝、安全性和肝炎病毒感染。

肝臟人源化小鼠的肝臟代謝酶和轉運體表達和功能已被證實與人類肝臟幾乎一致。此前HBV藥物非阿尿苷因嚴重肝毒性導致5人死亡而在臨床II期失敗。但在狗、猴、大鼠、小鼠實驗中并未發現其有肝臟毒性。當用非阿尿苷處理肝臟人源化小鼠，在低劑量情況下就能導致肝損傷，并能產生病人所有臨床癥狀和病理包括肝功能嚴重受損、脂肪肝和肝細胞線粒體破壞。因此肝臟人源化動物在臨床前進行藥物代謝、藥物相互作用和安全性評價中具有應用前景。

1990年Brinster實驗室構建了Alb-uPA小鼠。這種小鼠出生后會出現嚴重甚至致死的腸及腹腔出血。Joerg Petersen實驗室將Alb-uPA小鼠與Rag2^-/-免疫缺陷小鼠交配獲得了uPA/Rag2^-/-小鼠。通過人肝細胞脾臟移植，首次獲得再殖比例達(15％)的肝臟人源化小鼠。通過抑制補體反應及選取增殖能力強的人肝細胞，Katsutoshi Yoshizato實驗室在uPA/SCID小鼠中實現了極高比例(90％)的人肝細胞再殖。在該高再殖比例肝臟人源化小鼠中，人代謝酶的表達及誘導都和人肝臟非常接近。但是，目前Alb-uPA小鼠模型存在以下問題：第一，新生小鼠的死亡率很高，子代近半數于產后4天內死于腹腔或內臟出血，移植的窗口期很短(需在出生后2周內移植)；第二，存活的小鼠中僅部分是uPA基因攜帶者，而且部分小鼠還存在轉基因失活的問題；第三，移植的人肝細胞分泌的補體，對小鼠腎臟功能產生損傷，進一步增加了死亡率。

延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fuarylacetoacetate hydrolase，FAH)基因剔除小鼠(簡稱Fah^-/-小鼠)于1993年建立。Fah^-/-小鼠因不能進行完全的酪氨酸代謝而在肝臟中積累丁二酰，從而造成肝實質細胞的死亡。在飲用水中添加NTBC飼養的Fah^-/-小鼠與野生型小鼠表型無明顯區別、肝功能正常并可正常發育和繁殖，但在停止喂食NTBC后將在4～6周內因肝功能衰竭而死亡。Fah^-/-小鼠存在廣泛而持續的肝損傷，其肝臟微環境特別適合于移植細胞的增殖，野生性肝細胞(FAH基因表達正常)經脾臟移植后幾乎可以完全重建Fah^-/-小鼠的肝臟(90％以上)，受體小鼠恢復正常的肝功能。將Fah^-/-小鼠和Rag2^-/-IL2rg^-/-免疫缺陷小鼠雜交后，獲得三基因敲除的Fah^-/-Rag2^-/-IL2rg^-/-小鼠(FRG小鼠)。FRG小鼠缺少成熟的T、B細胞及NK細胞，當移植人肝細胞后，可以獲得很高程度(90％)的人肝細胞再殖。