[發(fā)明專利]一種人ATP7b基因外顯子PCR擴增系統(tǒng)、檢測試劑盒及其應(yīng)用的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810619125.0
• 申請日: 2018-06-15
• 公開（公告）號: CN108841929B
• 公開（公告）日: 2022-03-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 彭朝敏;金云舟;周巍;陳林;李明陽;鄧淑燕
• 申請（專利權(quán)）人: 上海五色石醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6883
• 代理公司: 上海上谷知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31342
• 代理人: 蔡繼清

本發(fā)明屬于人核酸體外檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為人ATP7b基因的PCR擴增檢測系統(tǒng)及其應(yīng)用。PCR擴增檢測系統(tǒng)包括：引物組、PCR反應(yīng)母液容器及Sanger Sequencing后的序列分析；引物組容器包含引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.42貯存液。本發(fā)明在DNA提取情況后(DNA質(zhì)量滿足要求：1.6≤OD260/OD280≤2.0，DNA最低濃度≥10.0ng/μL)，通過PCR反應(yīng)對人ATP7b基因21個外顯子目的片段同時擴增，通過目的片段的瓊脂糖凝膠電泳進行ATP7b基因外顯子有無缺失突變的判斷，進而進行電泳凝膠DNA的回收純化進行一代測序，通過測序片段的基因序列與Reference Sequence(權(quán)威數(shù)據(jù)庫中參考序列)進行比對，最終進行目標序列中有無單堿基突變的判斷，以期對人ATP7b基因全部外顯子進行金標準方法探討分析肝豆狀核變性在分子遺傳水平上的發(fā)病原因。而且，本方法操作簡單，使用儀器設(shè)備普及度很高，適合推廣使用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于人核酸體外檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人ATP7b基因21個外顯子PCR擴增及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

肝豆狀核變性(Hepatolenticular Degeneration，HLD或Wilson Disease，WD)是一種常染色體隱性遺傳性銅代謝障礙病，以銅代謝障礙引起的肝硬化、基底節(jié)損害為主的腦變性疾病為特點。肝豆狀核變性在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率在15～25/100萬，雜合子頻率約1:100。肝豆狀核性變是少數(shù)可以干預(yù)、治療的遺傳代謝疾病，早期發(fā)現(xiàn)，早期診斷和早期治療對于癥狀前患者、臨床出現(xiàn)癥狀患者預(yù)后有極其重要意義。

目前已經(jīng)明確WD基因(ATP7b)定位于13q14.3(圖1.A)，基因全長4.2Kb，含有21個外顯子(圖1.B)和20個內(nèi)含子，其cDNA編碼由1411氨基酸組成的P型Cu轉(zhuǎn)運ATP酶(ATP7Base)(圖1.C)，參與Cu的跨膜轉(zhuǎn)運過程，故又稱為ATP7b基因，ATP7b基因以點突變?yōu)橹鳎寻l(fā)現(xiàn)600多種突變，大多是雜合突變。

ATP7b基因內(nèi)一個或多個外顯子突變是導(dǎo)致肝豆狀核變性的根本原因，在國內(nèi)外的諸多研究顯示，ATP7b基因突變呈現(xiàn)地域差異及人種差異。在歐美國家，肝豆狀核性變基因Exon14第1069位密碼子突變是一個典型的熱點突變，突變頻率高達68.3％，而國內(nèi)學(xué)者對中國WD患者基因突變研究顯示Exon8的Arg778Leu突變頻率高達60％，為公認的第一突變熱點。

目前關(guān)于ATP7b基因突變的檢測方法，國內(nèi)外常用的分子檢測方法有:Sanger測序和DHPLC。Sanger Sequencing是通過設(shè)計ATP7b基因的21個外顯子或部分已知的突變熱點外顯子區(qū)域引物，以基因組DNA為模板進行常規(guī)PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖電泳確認電泳條帶后進行一代測序，測序結(jié)果與參考序列進行比對，最終確認目標擴增區(qū)域是否具有突變發(fā)生，該方法目前也是被認定為WD患者基因檢測的金標準。在此方法基礎(chǔ)上進行設(shè)計的如PCR-RFLP、STR等方法也常常被用于ATP7b基因的聯(lián)合分析。

變性高效液相色譜(Denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)是一種高通量篩選DNA序列變異的新技術(shù)，DHPLC是近來發(fā)展起來探索人類基因組DNA序列變異的新手段，亦稱為溫度調(diào)節(jié)的雜合雙鏈分析(TMHA)。它利用在部分變性條件下同源、異源雙鏈DNA解鏈特征的差異進行變異檢測。可以敏感而準確地發(fā)現(xiàn)DNA變異，能自動化操作，并能在數(shù)分鐘內(nèi)快速獲取實驗數(shù)據(jù)，且不存在假陽性或假陰性的問題，適用于大量人群篩選。該技術(shù)的高準確性和高敏感性在多種基因微小突變及多態(tài)性(SNPs)的研究中得到證實，因此，對于ATP7b這樣一個異質(zhì)性基因來說，DHPLC為一個理想方法，在實際臨床檢測方面應(yīng)用較廣。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種成本低、效率高、覆蓋全的能夠?qū)θ薃TP7b基因進行突變檢測的擴增系統(tǒng)，以及ATP7b基因突變篩查，輔以肝豆狀核變性致病的診斷分析。