[發(fā)明專利]用于控制昆蟲侵襲的核苷酸序列及其方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810618040.0
• 申請日: 2018-06-15
• 公開（公告）號: CN110669761B
• 公開（公告）日: 2022-11-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張愛紅;丁德榮;陶青;李曉嬌
• 申請（專利權(quán)）人: 北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A01N57/16;A01P7/04;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46;A01H6/54
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本發(fā)明涉及一種用于控制昆蟲侵襲的核苷酸序列及其方法，所述分離的多核苷酸序列包括：(a)SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列；或(b)SEQ ID NO:1的至少15個或17個或19個或21個連續(xù)核苷酸的多核苷酸序列，其中鞘翅目昆蟲害蟲攝取包含與所述多核苷酸序列互補(bǔ)的至少一條鏈的雙鏈RNA，抑制所述鞘翅目昆蟲害蟲的生長；或(c)SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:6所示的任一多核苷酸序列；或(d)在嚴(yán)格條件下與上述(a)、(b)或(c)限定的多核苷酸序列雜交或互補(bǔ)的多核苷酸序列。本發(fā)明首次公開了用于控制鞘翅目昆蟲害蟲雙斑螢葉甲的靶標(biāo)基因c4506的多條靶標(biāo)序列，高效、特異、方便且成本低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于控制昆蟲侵襲的核苷酸序列及其方法，特別是涉及一種利用RNAi技術(shù)降低或關(guān)閉雙斑螢葉甲體內(nèi)靶標(biāo)序列的表達(dá)來控制雙斑螢葉甲的方法。

背景技術(shù)

農(nóng)田作物通常是昆蟲攻擊的目標(biāo)。在過去數(shù)十年中，關(guān)于開發(fā)用于作物中昆蟲侵襲的更為有效的方法和組合物，已有了一些實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展。化學(xué)殺蟲劑對于控制有害生物侵襲是比較有效的手段。但是，使用化學(xué)殺蟲劑同時也有很多缺點(diǎn)。首先化學(xué)殺蟲劑是非選擇性的，人們意欲應(yīng)用化學(xué)殺蟲劑來控制對多種作物和其他植物來說有害的昆蟲，但是由于其缺乏選擇性，化學(xué)殺蟲劑對于非目標(biāo)的生物也會造成傷害，例如蚯蚓等。并且，在化學(xué)殺蟲劑應(yīng)用過的一段時間，通常會使田野貧瘠。化學(xué)殺蟲劑持續(xù)存在于環(huán)境中，通常很慢被代謝。這種緩慢代謝，使得作物及環(huán)境中存在化學(xué)殺蟲劑的殘留，它們會積累于食物鏈中，特別是高等食肉動物的食物鏈中。這些化學(xué)殺蟲劑的積累導(dǎo)致對更高端的物種誘導(dǎo)了疾病，例如人類的癌癥。因此人們強(qiáng)烈需要對環(huán)境友善的方法用于控制或根除作物生產(chǎn)中的昆蟲侵襲，即選擇性的，環(huán)境友好的，生物可降解的，并且能很好地用于有害生物抗性管理體系的方法。

在過去的幾十年中，開發(fā)用于控制植物蟲害的有效方法已取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展。化學(xué)殺蟲劑雖然對于根除植物害蟲非常有效，但是其對于非靶標(biāo)昆蟲也會施加作用，同時化學(xué)殺蟲劑持續(xù)存在于環(huán)境中，不僅對環(huán)境造成不可逆的污染，還會導(dǎo)致抗藥性昆蟲的出現(xiàn)。微生物殺蟲劑，特別是從蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)菌株所獲得的殺蟲劑，作為化學(xué)殺蟲劑的替代品，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用，其對包括鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等昆蟲具有一定的殺蟲活性，但是微生物殺蟲劑對于施藥環(huán)境的要求比較高，如果環(huán)境不適合這些微生物的生長，在生產(chǎn)上則需要重復(fù)施用，有些甚至重復(fù)施用也不能達(dá)到控制害蟲的目的，大大增加了生產(chǎn)成本。通過基因工程將編碼Bt殺蟲蛋白的一種或多種基因轉(zhuǎn)入植物中，可獲得一些害蟲抗性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物，例如經(jīng)基因工程產(chǎn)生Cry毒素的玉米和棉花植物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于美國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，并且為農(nóng)民提供了傳統(tǒng)害蟲控制方法的可選方案。但是目前開發(fā)的含有Cry毒素的轉(zhuǎn)基因作物只能用于防治范圍相對狹窄的鞘翅目害蟲，如玉米根蟲和科羅拉多馬鈴薯甲蟲，而對于目前玉米的主要害蟲之一—雙斑螢葉甲，尚未有應(yīng)用Cry毒素進(jìn)行防治的相關(guān)報(bào)道。與此同時，雙斑螢葉甲以卵存于土中越冬，次年6月份幼蟲孵化后也在土中活動；而由于近年來秸稈還田的大規(guī)模普及，使得利用化學(xué)殺蟲劑防治雙斑螢葉甲的難度逐年上升，特別是在7月底至8月初，雙斑螢葉甲成蟲出土，而此時玉米已經(jīng)長高，更加無法應(yīng)用化學(xué)殺蟲劑進(jìn)行防治。

RNA干擾或RNAi是用以在細(xì)胞或整個生物體環(huán)境下以序列特異性方式下調(diào)基因表達(dá)的一種方法，其通過特異性靶向選擇和高效mRNA遏制，可以達(dá)到定向干涉靶基因表達(dá)的目的。雖然利用RNAi技術(shù)來進(jìn)行害蟲防治是本領(lǐng)域的已知的，但是鑒于昆蟲的種類繁多，故這種技術(shù)不僅在不同昆蟲中的作用效果差別很大，而且將這種技術(shù)用作控制昆蟲侵襲措施的關(guān)鍵因素還在于選擇最適當(dāng)?shù)陌谢颍垂δ苋笔?dǎo)致必需生物過程嚴(yán)重破壞和/或生物體死亡的那些基因。因此，本發(fā)明將下調(diào)害蟲中的特定靶基因作為一種手段來實(shí)現(xiàn)控制昆蟲侵襲，特別是控制植物的昆蟲侵襲。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于控制昆蟲侵襲的核苷酸序列及其方法，即利用RNAi技術(shù)來下調(diào)靶標(biāo)基因的表達(dá)：削弱昆蟲存活、生長、繁殖、定殖特定環(huán)境和/或侵襲寄主的能力，以實(shí)現(xiàn)控制昆蟲侵襲及由其造成的損害。