[發(fā)明專利]一種高密度培養(yǎng)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶產(chǎn)生菌的方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810616526.0
• 申請(qǐng)日: 2018-06-15
• 公開（公告）號(hào): CN108624513B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳紅光
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 成都本則生科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/14
• 分類號(hào): C12N1/14;C12P41/00;C12P7/42;C12R1/645
• 代理公司: 北京中濟(jì)緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 李涵

本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵及酶轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高密度培養(yǎng)D?泛解酸內(nèi)酯水解酶產(chǎn)生菌的方法，并進(jìn)一步公開利用所述D?泛解酸內(nèi)酯水解酶產(chǎn)生菌進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化制備D?泛解酸的方法。本發(fā)明所述高密度培養(yǎng)D?泛解酸內(nèi)酯產(chǎn)生菌的方法，僅利用現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的串珠鐮孢菌為產(chǎn)酶菌株，并通過對(duì)種子培養(yǎng)基以及發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，有效提高了產(chǎn)酶菌株的生物量，同時(shí)有效提高了同時(shí)有效提高了粗酶液的酶，以及單位菌量的相對(duì)酶活。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵及酶轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高密度培養(yǎng)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶產(chǎn)生菌的方法，并進(jìn)一步公開利用所述D-泛解酸內(nèi)酯水解酶產(chǎn)生菌進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化制備D-泛解酸的方法。

背景技術(shù)

泛酸，又稱遍多酸、維生素B5，廣泛存在于生物界中，是動(dòng)物體內(nèi)合成輔酶A的主要原料，其主要作用是參與糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝。人體缺乏泛酸會(huì)引起肌肉酸痛或痙攣、腎上腺機(jī)能不足和減退、注意力不集中、手腳麻木、便秘、精力缺乏、輕微鍛煉后即筋疲力盡、憂慮、緊張以及磨牙等癥狀。泛酸以其特有的生化功能廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、飼料和食品等領(lǐng)域。而D-泛解酸內(nèi)酯(D-PL)則是合成D-泛酸系列產(chǎn)品最重要的手型中間體。

現(xiàn)有技術(shù)中通常只能由化學(xué)合成的方法制得DL-泛解酸內(nèi)酯，在進(jìn)行DL-泛解酸內(nèi)酯的拆分。DL-泛解酸內(nèi)酯的拆分方法大都是采用化學(xué)方法，其缺點(diǎn)是拆分劑昂貴，成本高，且分離困難。生物拆分方法中，采用微生物酶法拆分DL-泛解酸內(nèi)酯，因具有環(huán)境污染和毒性少等特點(diǎn)而成為研究的一個(gè)重要方向。

微生物酶法拆分DL-泛解酸內(nèi)酯的一種方式是利用產(chǎn)L-泛解酸內(nèi)酯酶的微生物，分解DL-泛解酸內(nèi)酯中的L-泛解酸內(nèi)酯，得到未分解的D-構(gòu)型泛解酸內(nèi)酯；此方法的缺點(diǎn)只有L-構(gòu)型的內(nèi)酯被水解得非常徹底才能得到高光學(xué)純度的D-泛解酸內(nèi)酯，并且反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，而且長(zhǎng)時(shí)間的水解過程會(huì)導(dǎo)致一部分D-泛解酸內(nèi)酯水解，導(dǎo)致得到的產(chǎn)物D-泛解酸內(nèi)酯收率不高；另一種方式是利用產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯酶的微生物，選擇性水解DL-泛解酸內(nèi)酯中的D-泛解酸內(nèi)酯，進(jìn)而得到D-泛解酸，再將D-泛解酸進(jìn)行內(nèi)酯化生成D-泛解酸內(nèi)酯；該方法水解時(shí)間短，雖然水解率不高(30％左右)，但未水解的L-泛解酸內(nèi)酯可消旋后再利用，產(chǎn)物的總體收率較高，因此，成為現(xiàn)有技術(shù)中制備D-泛解酸和D-泛解酸內(nèi)酯的主流方法。

現(xiàn)有技術(shù)中已知報(bào)道的能產(chǎn)生D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的菌株包括尖鐮孢霉菌、串珠鐮孢霉菌等，但通常野生型菌株的發(fā)酵密度和酶活力都較低，影響了后續(xù)酶轉(zhuǎn)化步驟對(duì)DL-泛解酸內(nèi)酯的酶轉(zhuǎn)化率，這也成為了限制微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-泛解酸工藝的技術(shù)難題。而如何有效提高發(fā)酵菌株的發(fā)酵密度并進(jìn)一步提高DL-泛解酸內(nèi)酯底物的酶轉(zhuǎn)化率成為亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種高密度培養(yǎng)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶產(chǎn)生菌的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶菌株發(fā)酵密度及酶活力較低導(dǎo)致D-泛解酸酶轉(zhuǎn)化率較低的問題；

本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題在于提供一種微生物轉(zhuǎn)化法制備D-泛解酸的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中微生物轉(zhuǎn)化法制備D-泛解酸的轉(zhuǎn)化率較低的問題。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所述的一種高密度培養(yǎng)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶產(chǎn)生菌的方法，包括如下步驟：

(1)將斜面保存的串珠鐮孢菌接種入種子培養(yǎng)基中進(jìn)行種子活化；所述種子培養(yǎng)基包括：甘油5-10g/L、荸薺漿20-30g/L、蛋白胨6-10g/L、天冬酰胺3-8g/L、硫酸銨2-4g/L，調(diào)pH7.0-8.0；