[發(fā)明專利]一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸類化合物生物合成方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810613079.3
• 申請日: 2018-06-14
• 公開（公告）號: CN110607335B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳義華;丁勇
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號: C12P19/36
• 分類號: C12P19/36;C12P17/12;C12P13/04;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;秦夢楠

本發(fā)明公開了一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸類化合物生物合成方法。本發(fā)明提供的合成路徑以分支酸為起點(diǎn)，在PhzD蛋白的作用下經(jīng)過轉(zhuǎn)氨重排反應(yīng)生成氨基脫氧異分支酸，氨基脫氧異分支酸在PhzE蛋白的催化下脫去丙酮酸部分生成2,3?二氫?3?羥基鄰氨基苯甲酸，采用特定酶將2,3?二氫?3?羥基鄰氨基苯甲酸催化生成3?羥基鄰氨基苯甲酸，在nabC蛋白的作用下3?羥基鄰氨基苯甲酸通過氧化開環(huán)重排反應(yīng)生成喹啉酸，隨后進(jìn)入NAD補(bǔ)救途徑，完成NAD的合成。本發(fā)明解除了NAD合成與色氨酸或天冬氨酸合成的耦聯(lián)，同時，分支酸廣泛存在于各種生命形式中，且對其他生命必需代謝途徑的影響較小。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸類化合物生物合成方法。

背景技術(shù)

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺，輔酶Ⅰ)和它相應(yīng)的還原形態(tài)NADH是所有生命活動必不可少的輔酶之一，它們作為質(zhì)子的受體或供體參與了多種生物體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)。另外，在細(xì)胞的生長、分化、調(diào)節(jié)和疾病等非氧化還原生命過程中,NAD⁺同樣起到非常重要的作用，如參與衰老相關(guān)的組蛋白脫乙酰化反應(yīng)、DNA修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用的聚腺苷二磷酸核糖反應(yīng)、調(diào)控鈣離子通道的腺苷二磷酸核糖環(huán)化反應(yīng)等。近年來，越來越多的研究表明，體內(nèi)NAD的減少是衰老的一個重要原因。在一些發(fā)酵產(chǎn)業(yè)和生物轉(zhuǎn)化中，NAD⁺(NADH)的添加可以提高產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化效率。

在生物體內(nèi)，NAD的生物合成包括從頭合成途徑和補(bǔ)救途徑。NAD的補(bǔ)救途徑廣泛存在于各種生物體內(nèi)，主要指生物通過直接攝取(如動物從食物中獲取、細(xì)菌從培養(yǎng)基中攝取等)并利用煙酸及煙酰胺作為前體來合成NAD的過程。生物中已知的NAD從頭合成有兩條途徑：a.天冬氨酸途徑；b.色氨酸-犬尿酸途徑。一般情況下，細(xì)菌和植物(包括部分古菌)中NAD的從頭合成利用的是天冬氨酸途徑：天冬氨酸在天冬氨酸氧化酶的作用下形成α-亞胺琥珀酸，接著在喹啉酸合酶作用下與磷酸二羥丙酮發(fā)生縮合生產(chǎn)喹啉酸，隨后喹啉酸在喹啉酸磷酸轉(zhuǎn)移酶的作用下與焦磷酸核糖反應(yīng)生成煙酸單核苷酸(NAMN)進(jìn)入補(bǔ)救途徑合成NAD。在酵母和哺乳動物等真核生物中，NAD一般是以色氨酸為前體從頭合成的：色氨酸經(jīng)過犬尿酸途徑降解生成3-羥基鄰氨基苯甲酸后，3,4位雙加氧重排縮合形成喹啉酸，經(jīng)過與天冬氨酸類似的方式進(jìn)入NAD的補(bǔ)救合成途徑合成NAD類化合物。

生物在通過上述兩條從頭合成途徑合成NAD類化合物時，需要消耗合成蛋白質(zhì)的氨基酸(色氨酸或天冬氨酸)，這從一定程度上限制了這類化合物在生物體內(nèi)的濃度，導(dǎo)致目前通過酵母發(fā)酵生產(chǎn)這類化合物成本較高。另外，通過體外酶催化轉(zhuǎn)化法制備NAD需要純化相應(yīng)的蛋白酶和消耗昂貴的前體ATP，生產(chǎn)成本也很高。通過化學(xué)全合成生產(chǎn)NAD的方法還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸類化合物生物合成方法。

本發(fā)明提供了一種合成喹啉酸的方法(方法甲)，包括如下步驟：

(1)以分支酸為起始物，經(jīng)過轉(zhuǎn)氨重排反應(yīng)生成氨基脫氧異分支酸；

(2)氨基脫氧異分支酸脫去丙酮酸部分生成2,3-二氫-3-羥基鄰氨基苯甲酸；

(3)2,3-二氫-3-羥基鄰氨基苯甲酸脫氫生成3-羥基鄰氨基苯甲酸；

(4)3-羥基鄰氨基苯甲酸通過氧化開環(huán)重排反應(yīng)生成喹啉酸。

本發(fā)明還保護(hù)一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的合成方法(方法乙)，包括如下步驟：

(a)按方法甲制備得到喹啉酸；

(b)喹啉酸在喹啉酸磷酸轉(zhuǎn)移酶的作用下與焦磷酸核糖反應(yīng)生成煙酸單核苷酸；

(c)利用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的補(bǔ)救合成途徑，完成從煙酸單核苷酸到煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的制備。