[發明專利]用于鑒定銹赤扁谷盜的實時熒光PCR引物及探針

在審

• 申請號: 201810607685.4
• 申請日: 2018-06-13
• 公開（公告）號: CN110592229A
• 公開（公告）日: 2019-12-20
• 發明（設計）人: 李志紅;陳冬旭
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 11245 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關暢;張立娜

本發明公開了一種用于鑒定銹赤扁谷盜的實時熒光PCR引物及探針。本發明提供了用于鑒定銹赤扁谷盜的組合物，由一個引物對和一個探針組成的組合物；所述引物對由引物1和引物2組成，所述引物1的序列如SEQ ID No.1所示，所述引物2的序列如SEQ ID No.2所示；所述探針的序列為SEQ ID No.3。本發明所提供的鑒定銹赤扁谷盜的實時熒光PCR方法具有操作簡便、耗時較短、特異性強、靈敏度高且較穩定，結果直觀等特點，為進一步鑒定扁谷盜屬近緣種的研究奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種用于鑒定銹赤扁谷盜的實時熒光PCR引物及探針。

背景技術

實時熒光PCR分子鑒定技術是一種使用特異引物和熒光探針對樣品DNA進行 PCR擴增，通過監測反應體系中熒光信號的有無及強度，判斷目標DNA的有無，從而達到種類鑒定的目的的分子鑒定技術。

TaqMan探針是一種在實時熒光PCR鑒定中常用的熒光探針。TaqMan是一段5’端標記一個熒光報告基團，3’端標記一個熒光猝滅基團的寡核苷酸，通常與設計得到的特異引物組合進行DNA的分子鑒定。當探針完整時，報告基團發射的熒光信號被猝滅基團吸收；PCR擴增時，由于TaqMan探針較高的退火溫度，先結合到目標序列上，隨后引物結合，Taq酶的5’-3’核酸外切酶活性將探針酶切降解，使報告基團和淬滅基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號。隨著反應的進行，體系中的熒光信號逐漸積累并被檢測。當擴增產物的熒光信號與背景熒光信號的差值達到認為設定的熒光閾值ΔR時所經過的循環次數稱為Ct值。通過生成的擴增曲線形狀及儀器檢測到的各體系Ct值，對擴增的有無及效率進行判斷。

傳統的扁谷盜分類鑒定方法都是建立在其成蟲外部形態特征的基礎上的。但由于扁谷盜類儲糧害蟲形態上的特殊性，使得對其的準確鑒定尤為困難：扁谷盜屬某些種類個體微小(體長通常小于2mm)，種間的外部形態極為相似，常常伴隨多種混生，使得其成蟲的形態學鑒定極為困難；為了正確地鑒定種，除外部形態之外，必須觀察成蟲的外生殖器骨片，此過程復雜，操作難度高；在實際的口岸檢疫及糧倉采樣中，獲得的成蟲常常不完整，伴隨著如觸角、足等重要形態學鑒定特征的缺失，這就使得基于成蟲特征的形態學鑒定無法順利進行；目前還沒有建立對扁谷盜類儲糧害蟲卵和幼蟲進行形態學鑒定的方法，對于非成蟲階段的扁谷盜樣品，依賴于成蟲形態特征的鑒定無法進行；此外，生存環境對其外部表型又有一定的影響。

現有的分子鑒定技術有DNA條形碼鑒定技術和基于DNA條形碼的特異引物PCR 技術。然而，DNA條形碼鑒定技術需要對PCR擴增產物進行測序比對，耗時長。基于DNA條形碼的特異引物PCR技術在對經特異引物常規PCR擴增的產物進行檢測時，樣品間可能產生交叉污染，從而引發假陽性問題。

發明內容

為了有效解決上述技術問題，本發明提供了一種用于鑒定銹赤扁谷盜的實時熒光PCR引物及探針。

第一方面，本發明要求保護一種用于鑒定銹赤扁谷盜的組合物。

本發明所提供的用于鑒定銹赤扁谷盜的組合物，由一個引物對和一個探針組成的組合物；所述引物對由引物1和引物2組成，所述引物1的序列如SEQ ID No.1所示，所述引物2的序列如SEQ ID No.2所示；所述探針的序列為SEQ ID No.3。

其中，所述組合物中的所述引物1、所述引物2和所述探針分別單獨包裝。

第二方面，本發明要求保護一種用于鑒定銹赤扁谷盜的探針。

本發明所提供的用于鑒定銹赤扁谷盜的探針，其具體序列為SEQ ID No.3。

在第一方面和第二方面中，所述探針的5’端可標記有報告熒光染料A，3’端可標記有淬滅熒光染料B。

在本發明的具體實施方式中，所述報告熒光染料A具體為FAM；所述淬滅熒光染料B具體為BHQ。