[發(fā)明專利]一種結直腸癌實體瘤原代細胞的培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810607216.2
• 申請日: 2018-06-13
• 公開（公告）號: CN110592018A
• 公開（公告）日: 2019-12-20
• 發(fā)明（設計）人: 張函槊;尹申意
• 申請（專利權）人: 北京吉尚立德生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 11245 北京紀凱知識產(chǎn)權代理有限公司
• 代理人: 關暢;張立娜

本發(fā)明公開了一種結直腸癌原代細胞的培養(yǎng)方法。本發(fā)明提供了一種結直腸癌實體瘤原代細胞培養(yǎng)方法及配套試劑，該技術的核心是：(1)用溫和細胞解離試劑處理結直腸癌實體瘤組織，最大程度的保證了組織中癌細胞的活力；(2)配制特殊的無血清培養(yǎng)基，利用懸浮培養(yǎng)體系對結直腸癌實體瘤來源的腫瘤細胞進行體外培養(yǎng)，保證癌細胞正常擴增的同時最大限度的排除正常細胞的干擾。利用本發(fā)明方法得到的結直腸癌原代細胞培養(yǎng)物可以用于多種細胞水平的體外實驗、二代測序、構建動物模型、構建細胞系等等。可以預見，這種培養(yǎng)方法在結直腸癌的研究和臨床診斷治療領域具有廣泛的應用前景。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種結直腸癌實體瘤原代細胞的培養(yǎng)方法。

背景技術

結直腸癌是最常見的嚴重威脅人類的健康惡性腫瘤之一。在我國結直腸癌的發(fā)病率為9.24％，在所有惡性腫瘤中占第四位。而結直腸癌的死亡率為11.77％，在全部惡性腫瘤中占第五位。隨著經(jīng)濟的發(fā)展、生活水平的提高和生活方式的改變，結直腸癌的發(fā)病率還將呈不斷上升的趨勢。另外，結直腸癌復發(fā)轉移風險高，超過50％的結直腸癌患者會在根治性治療后數(shù)月到數(shù)年內(nèi)出現(xiàn)不同程度的復發(fā)轉移。

盡管世界各國的科研和醫(yī)療機構對結直腸癌的病因以及發(fā)生發(fā)展過程的研究都有很大力度的投入，但是人類對這種疾病仍然知之甚少。結直腸癌是一種復雜疾病，其發(fā)生、發(fā)展是一個動態(tài)的過程，涉及到諸多信號分子相互作用，形成了一個復雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡，同時還受到外界環(huán)境因素的影響。結直腸癌的病因和發(fā)生發(fā)展過程有很強的個體差異性，不能一概而論。因此將結直腸癌實體瘤原代細胞培養(yǎng)物作為模型進行個體化精準研究是結直腸癌研究領域乃至結直腸癌診斷治療領域的趨勢。

現(xiàn)有的原代腫瘤細胞培養(yǎng)技術主要有2D培養(yǎng)，3D培養(yǎng)，重編程培養(yǎng)等幾類，這些方法都不同程度的面臨培養(yǎng)周期極長，培養(yǎng)成功率低，雜細胞難以去除等問題。

發(fā)明內(nèi)容

為了有效解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種新的結直腸癌實體瘤原代細胞培養(yǎng)技術及配套試劑，該技術的核心是：(1)用溫和細胞解離試劑處理結直腸癌實體瘤組織，最大程度的保證了組織中癌細胞的活力；(2)配制特殊的無血清培養(yǎng)基，利用懸浮培養(yǎng)體系對結直腸癌實體瘤來源的腫瘤細胞進行體外培養(yǎng)，保證癌細胞正常擴增的同時最大限度的排除正常細胞的干擾。

第一方面，本發(fā)明要求保護一種培養(yǎng)結直腸癌實體瘤原代細胞的方法。

本發(fā)明所提供的培養(yǎng)結直腸癌實體瘤原代細胞的方法，具體可包括如下步驟：

(1)用樣本解離液對結直腸癌實體瘤組織進行解離處理，獲得結直腸癌實體瘤原代細胞；

所述樣本解離液由膠原酶I、膠原酶II、膠原酶IV和PBS組成；其中，所述膠原酶I在所述樣本解離液中的終濃度為150-250U/mL(如200U/mL)；所述膠原酶II在所述樣本解離液中的終濃度為150-250U/mL(如200U/mL)；所述膠原酶IV在所述樣本解離液中的終濃度為50-150U/mL(如100U/mL)；余量均為PBS。

其中，用蛋白酶的酶活來定義膠原酶(所述膠原酶I、所述膠原酶II或所述膠原酶IV)的單位U：在37℃，pH 7.5的條件下，用1U蛋白酶處理膠原酶(所述膠原酶I、所述膠原酶II或所述膠原酶IV)5小時，可以釋放L-亮氨酸1μmol。

在本發(fā)明的具體實施例中，所述膠原酶I的品牌貨號為Gibco#17100-017；所述膠原酶II的品牌貨號為Gibco#17101-015；所述膠原酶IV的品牌貨號為Gibco#17104-019；所述PBS的品牌貨號為Gibco#21-040-CVR。

(2)利用結直腸癌實體瘤原代細胞培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)步驟(1)解離出來的結直腸癌實體瘤原代細胞；