[發明專利]一種結直腸癌實體瘤原代細胞的培養方法

在審

• 申請號: 201810607216.2
• 申請日: 2018-06-13
• 公開（公告）號: CN110592018A
• 公開（公告）日: 2019-12-20
• 發明（設計）人: 張函槊;尹申意
• 申請（專利權）人: 北京吉尚立德生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 11245 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關暢;張立娜

1.一種培養結直腸癌實體瘤原代細胞的方法，包括如下步驟：

(1)用樣本解離液對結直腸癌實體瘤組織進行解離處理，獲得結直腸癌實體瘤原代細胞；

所述樣本解離液由膠原酶I、膠原酶II、膠原酶IV和PBS組成；其中，所述膠原酶I在所述樣本解離液中的終濃度為150-250U/mL；所述膠原酶II在所述樣本解離液中的終濃度為150-250U/mL；所述膠原酶IV在所述樣本解離液中的終濃度為50-150U/mL；余量均為PBS；

(2)利用結直腸癌實體瘤原代細胞培養基懸浮培養步驟(1)解離出來的結直腸癌實體瘤原代細胞；

所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基由所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基由抗菌抗真菌劑三抗、HEPES、GlutaMax、人重組蛋白EGF、人重組蛋白bFGF、人重組蛋白HGF、人重組蛋白Wnt-3a、人重組蛋白Noggin、SB202190、A83-01、Primocin^TM、N-乙酰-L-半胱氨酸、煙堿、N-2Supplement、皮質醇、B27、ITS-X、Y-27632和Advanced DMEM/F12培養基組成；其中，所述抗菌抗真菌劑三抗中的青霉素在所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基中的終濃度為100-200U/mL；所述抗菌抗真菌劑三抗中的鏈霉素在所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基中的終濃度為100-200μg/mL；所述抗菌抗真菌劑三抗中的兩性霉素B在所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基中的終濃度為250-250ng/mL；所述HEPES在所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基中的終濃度為8-12mM；所述GlutaMax在所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基中的終濃度為0.8-1.2％(體積百分含量)；所述人重組蛋白EGF在所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基中的終濃度為10-100ng/mL；所述人重組蛋白bFGF在所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基中的終濃度為10-50ng/mL；所述人重組蛋白HGF在所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基中的終濃度為5-25ng/mL；所述人重組蛋白Wnt-3a在所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基中的終濃度為200-300ng/mL；所述人重組蛋白Noggin在所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基中的終濃度為100-200ng/mL；所述SB202190在所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基中的終濃度為5-10μM；所述A83-01在所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基中的終濃度為0.25-1.25μM；所述Primocin^TM在所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基中的終濃度為1％(體積百分含量)；所述N-乙酰-L-半胱氨酸在所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基中的終濃度為0.5-2mM；所述煙堿在所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基中的終濃度為5-10mM；所述N-2Supplement在所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基中的終濃度為1％(體積百分含量)；所述皮質醇在所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基中的終濃度為20-50ng/mL；所述B27在所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基中的終濃度為1.5-2.5％(體積百分含量)；所述ITS-X在所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基中的終濃度為0.8-1.2％(體積百分含量)；所述Y-27632在所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基中的終濃度為5-20μM；余量均為AdvancedDMEM/F12培養基。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(1)中，是按照包括如下步驟的方法用所述樣本解離液對所述結直腸癌實體瘤組織進行解離的：按0.1-0.3mL所述樣本解離液每mg組織的用量，將剪碎后的所述結直腸癌實體瘤組織用事先37℃預熱的所述樣本解離液進行處理，在37℃條件下進行樣本解離，解離時間15分鐘至3小時。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：步驟(2)中，是按照包括如下步驟的方法用所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基懸浮培養所述結直腸癌實體瘤原代細胞的：使用具有低吸附表面的培養容器，利用所述結直腸癌實體瘤原代細胞培養基懸浮培養所述結直腸癌實體瘤原代細胞，37℃，5％CO₂條件下進行培養，每2-4天更換一次培養基。