[發(fā)明專利]一種大腸桿菌O157:H7的PSR檢測引物、試劑盒及其檢測方法

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• 申請日: 2018-06-13
• 公開（公告）號: CN108796099A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉君彥;徐振波;徐行勇;徐瑞瑞;劉麗艷;蘇健裕;李冰;李琳
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 劉瑜

本發(fā)明公開了一種大腸桿菌O157:H7的PSR檢測引物、試劑盒及其檢測方法。該引物包括檢測引物Ft、Bt，以及加速引物IF、IB；其中，檢測引物Ft的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；檢測引物Bt的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；加速引物IF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；加速引物IB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本發(fā)明還提供了一種大腸桿菌O157:H7的PSR檢測試劑盒，可在40分鐘左右獲得檢測結(jié)果，同時確保檢測的可靠性、特異性和靈敏度，特別適用中小型單位及現(xiàn)場檢測，且對于提高重大群體疾病診斷率，早期的疾病診斷具有非常重要的意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種大腸桿菌O157:H7的PSR檢測引物、試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)

對病原微生物進行準確的鑒定，對于由食源性微生物引發(fā)的食品安全事故及指導合理治療方式具有重要的意義。目前微生物的檢測鑒定方法主要分為以下三大類：分離培養(yǎng)鑒定法、免疫學檢測及核酸檢測。分離培養(yǎng)鑒定法操作繁瑣、實驗周期長，對實驗人員專業(yè)水平要求高。免疫學檢測手段則需要制備昂貴的單克隆抗體，對樣本要求較高，對于復雜樣本無法檢測。而核酸檢測則大多基于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)法和熒光定量PCR法，這兩種方法需要昂貴的儀器設(shè)備，檢測成本較高，不適合中小型單位和現(xiàn)場檢測的應(yīng)用。

目前對于大腸桿菌O157的核酸檢測主要采用PCR及環(huán)介導等溫擴增技術(shù)。而目前應(yīng)用最廣泛的恒溫擴增技術(shù)-LAMP也有它的局限性，如引物設(shè)計復雜、假陽性率高、試劑價高偏高，且由于日本知識產(chǎn)權(quán)的保護，我國在轉(zhuǎn)化應(yīng)用上局限性強。聚合酶螺旋反應(yīng)(Polymerase Spiral Reaction,PSR)技術(shù)與其他核酸擴增技術(shù)相比，可以在等溫條件下快速、高效、特異地擴增靶序列，且操作簡便，不需要精準的變溫設(shè)備，成本較低，在食源性微生物檢測領(lǐng)域顯示出廣闊的發(fā)展前景。因此，建立一種針對大腸桿菌O157:H7新型的具有獨立知識產(chǎn)權(quán)的等溫核酸擴增方法具有重要的意義。

Escherichia coli O157:H7是腸出血大腸桿菌最重要的血清型，主要通過食用污染的食物，如生的或絞碎的肉制品、生牛奶和受污染的蔬菜和芽菜向人類傳播，感染人體后表現(xiàn)為相應(yīng)的臨床癥狀。輕度感染可引起腹部絞痛和腹瀉，發(fā)燒和嘔吐也可能出現(xiàn)，潛伏期一般為3～8天，10天即可自愈。重度感染則表現(xiàn)為出血性結(jié)腸炎，溶血性尿毒綜合征。E.coliO157:H7感染劑量極低，食入不足五個細菌就可引起疾病，且病情發(fā)展快。自1982年美國首次發(fā)現(xiàn)因E.coli O157:H7引起的食物中毒以來，疫情開始擴散和蔓延，相繼在中國、英國、加拿大、日本等多個國家引起發(fā)病，對人類健康構(gòu)成了重大威脅。目前由E.coliO157:H7感染引起的食源性疾病已經(jīng)成為世界性的衛(wèi)生問題。因此有必要建立一種快速低成本的檢測E.coliO157:H7的檢測方法及其試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種大腸桿菌O157:H7的PSR檢測引物。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種大腸桿菌O157:H7的PSR檢測試劑盒。

本發(fā)明的又一目的在于提供所述大腸桿菌O157:H7的PSR檢測試劑盒的應(yīng)用。

本發(fā)明的再一目的在于提供一種大腸桿菌O157:H7的PSR檢測方法。該方法具有靈敏度高、特異性好，操作簡便快速，結(jié)果準確可靠，檢測成本低，適合現(xiàn)場檢測應(yīng)用的特點。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種大腸桿菌O157:H7的PSR檢測引物，包括檢測引物Ft、Bt，以及加速引物IF、IB，其核苷酸序列如下所示：

檢測引物Ft:

5’-TTGGCATCGTGTGGACAGGGTAGGACCGCAGAGGAAAGA-3’(SEQ ID NO.1)；

檢測引物Bt：