[發明專利]一種大腸桿菌O157:H7的PSR檢測引物、試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201810606719.8
• 申請日: 2018-06-13
• 公開（公告）號: CN108796099A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 劉君彥;徐振波;徐行勇;徐瑞瑞;劉麗艷;蘇健裕;李冰;李琳
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 劉瑜

1.一種大腸桿菌O157:H7的PSR檢測引物，其特征在于：包括檢測引物Ft、Bt，以及加速引物IF、IB；其中，

檢測引物Ft的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

檢測引物Bt的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

加速引物IF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

加速引物IB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一種大腸桿菌O157:H7的PSR檢測試劑盒，其特征在于：包括權利要求1所述的大腸桿菌O157:H7的PSR檢測引物。

3.根據權利要求2所述的大腸桿菌O157:H7的PSR檢測試劑盒，其特征在于：

所述的上述大腸桿菌O157:H7的PSR檢測引物各引物的濃度均為50μM。

4.根據權利要求3所述的大腸桿菌O157:H7的PSR檢測試劑盒，其特征在于，還包括如下組分：

A、2×反應緩沖液：40.0mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸銨，20.0mM的氯化鉀，16.0mM的硫酸鎂，0.2％(v/v)的Tween 20，1.4M的甜菜堿，10.0mM的dNTPs；

B、Bst DNA聚合酶；

C、鈣黃綠素和氯化錳的混合溶液。

5.根據權利要求4所述的大腸桿菌O157:H7的PSR檢測試劑盒，其特征在于，組分C中所述的鈣黃綠素和氯化錳的混合溶液為通過如下方法制備得到：

(i)將鈣黃綠素溶于二甲基亞砜中，配置50μM的鈣黃綠素溶液；將氯化錳溶于水中，配置1mM的氯化錳水溶液；

(ii)取25μL 50μM的鈣黃綠素溶液與10μL1mM的氯化錳水溶液混合均勻，得到鈣黃綠素和氯化錳的混合溶液。

6.根據權利要求4所述的大腸桿菌O157:H7的PSR檢測試劑盒，其特征在于：

組分B中所述的Bst DNA聚合酶為濃度為8U/μL的Bst DNA聚合酶水溶液。

7.權利要求2～6任一項所述的大腸桿菌O157:H7的PSR檢測試劑盒在檢測大腸桿菌O157:H7中的應用。

8.一種大腸桿菌O157:H7的PSR檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提取待檢樣品的細菌DNA作為模板DNA；

(2)于65℃水浴中保溫40～45分鐘進行聚合酶螺旋擴增反應；其中，聚合酶螺旋擴增反應體系為26μL反應體系：2×反應緩沖液12.5μL，50μM的檢測引物Ft和50μM的檢測引物Bt各0.8μL，50μM的加速引物IF和50μM的加速引物IB各0.4μL，DNA模板2.0μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1.0μL，加水補足至25μL；最后加入1μL的鈣黃綠素與氯化錳的混合溶液；

(3)待反應完成后于80℃水浴中保溫2分鐘終止反應，然后用肉眼觀察顏色變化，如顏色為黃色，說明待檢樣品中不含有大腸桿菌O157:H7；如顏色變為綠色，說明待檢樣品中含有大腸桿菌O157:H7；

步驟(2)中所述的檢測引物Ft的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，檢測引物Bt的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，加速引物IF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，加速引物IB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。