[發明專利]牛及其早期胚胎性別鑒定的體系、方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201810604092.2
• 申請日: 2018-06-13
• 公開（公告）號: CN108796059A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 張國君;馮春濤;楊宇澤;余文莉;李樹靜;王慧;劉杰;陳初光
• 申請（專利權）人: 北京閱微基因技術有限公司;石家莊天泉良種奶牛有限公司
• 主分類號: C12Q1/6879
• 分類號: C12Q1/6879;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

本發明涉及牛及其早期胚胎性別鑒定的體系、方法及試劑盒，屬于生物技術檢測領域。利用牛折疊蛋白基因存在于牛X染色體上的特點，設計一組引物NB2?F NB2?R和探針NB2?P，本組探針專用于鑒別是牛的胚胎，其他物種的鑒別不出來，然后再利用公牛的特異性基因SRY,選取其序列進行引物及探針的特異性設計，設計出的引物BOV97M?F、BOV97M?R和探針BOV97M?P只會擴出公牛的樣本,將兩組探針組合構建一個復合檢測體系，成功鑒定牛早期胚胎的性別。本發明靈敏度高(可檢測3?5個細胞)，樣本處理快，檢測速度快，成本低等優點，另外還有效地避免了多重PCR和巢式PCR所帶來的污染，檢出率和準確率100％。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，特別是涉及一種牛及其早期胚胎性別鑒定方法，是現有技術的優化升級及完美補充。

背景技術

動物的某些生產性狀受性別限制或受性別影響，如奶牛只有母牛才表現產奶性狀，而肉牛生產中公畜因為生長速度快而具有較高的經濟價值，為充分發揮奶牛的繁殖能力和公牛的生長優勢，人為地控制牛的性別一直是人們追求的目標，因此快速準確地鑒別家畜早期胚胎性別并實施性別控制技術，是提高畜牧業經濟效益的重要措施.

以往的PCR性別鑒定均采用持家基因作為內標引物，利用性別特異的SRY基因設計引物進行雙重PCR擴增分析，并且多采用巢式PCR(nested-PCR)或基因組預擴增的方法對DNA模板進行富集，操作繁瑣，費時費力，易污染，技術難度較大，不便于現場操作。

而單重PCR法由于僅擴增Y染色體特異引物，避免了多重PCR中常染色體引物對Y染色體特異引物擴增的影響，方法簡便，但由于反應中沒有內標引物作為內部標記，就可能將沒有發生反應的樣品誤判為雌性，從而增加了鑒別結果假陰性的幾率，傳統的PCR法對胚胎樣本的需求量高，胚胎細胞數目較少的情況下，樣本處理后得到的模板很難都達到PCR擴增對模板的要求，就是巢式PCR擴增對于模板較低的情況擴增效果也不好，主要是因為普通PCR方法對模板濃度有一定要求，檢測靈敏度低，電泳檢測容易出現污染，因此開發一種檢測靈敏度高，檢出率和準確率高的牛胚胎鑒定復合體系成為當前的主要任務。

發明內容

本發明目的在于提供一種可檢測牛及其早期胚胎性別的復合探針體系，該方法結合運用Thermofisher公司QuantStudioTM 6 Flex熒光定量檢測儀器進行，檢測周期短，檢測靈敏度高，檢出率及準確率高。

本發明的另一個目的在于提供一種利用上述引物及探針檢測牛及其早期胚胎性別的熒光定量PCR檢測的復合探針體系，消除了常規PCR方法及巢式PCR方法電泳所帶來的污染。

本發明針對牛折疊蛋白基因是X染色體上共有的基因，因此可以將其作為牛的內參基因，用于檢測所送樣本是否為牛；而SRY基因是Y染色體上特有的基因，可以用來鑒定公牛的存在與否，二者結合就可以實現牛及早期胚胎的性別鑒定。

牛及其早期胚胎性別鑒定的PCR體系，其特征在于：PCR體系中包含有下列引物及探針，

內標引物NB2-F：CGGGACTGGACTGGGAT，

內標引物NB2-R：CTGACTCTACGACTGTCT，

內標探針NB2-P：CCTCGCATGCAGCT；

性別位點SRY基因引物BOV97M-F：AACCAGTGGCTAGCAGCATCAA，

性別位點SRY基因引物BOV97M-R：TTAGGAATCT ATATTGCAGCTT，

性別位點SRY基因探針BOV97M-P：CTGCTCGATAGCAACC。

所述PCR體系為熒光定量PCR體系，在探針上連接有熒光標記：

內標探針NB2-P：HEX-CCTCGCATGCAGCT-MGB；