[發(fā)明專利]一種細(xì)胞穿膜肽及其制備方法、應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810604034.X
• 申請(qǐng)日: 2018-06-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108794579A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐偉;郭曉霞;劉巖松;段茹;許力;柳項(xiàng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 肽澤(武漢)生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K7/08
• 分類號(hào): C07K7/08;C07K1/04;C12N15/87
• 代理公司: 武漢知產(chǎn)時(shí)代知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42238
• 代理人: 曹雄

1.一種細(xì)胞穿膜肽，其特征在于：所述細(xì)胞穿膜肽包括如下序列：

RRRRRKQARRPRRRRAR。

2.一種如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞穿膜肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、提供樹(shù)脂，且將所述樹(shù)脂在第一溶劑中浸泡至所述樹(shù)脂溶脹；

S2、將氨基酸、縮合劑溶于第二溶劑中，形成混合物；

S3、在所述混合物中加入溶脹的樹(shù)脂以形成反應(yīng)體系，反應(yīng)時(shí)間為1-4h；

S4、去除反應(yīng)后所述反應(yīng)體系中的溶液，對(duì)殘留物洗滌1-5次，氣體鼓動(dòng)，抽干；

S5、在所述殘留物中加入脫帽液，氣體鼓動(dòng)，抽干；

S6、去除經(jīng)由步驟S5后的反應(yīng)體系中的溶液，洗滌1-10次，氣體鼓動(dòng)，抽干，由此獲得合成的多肽鏈；

S7、在所述多肽鏈中加入切割液，在4-30℃下攪拌1-4h，過(guò)濾得濾液，且洗滌所述濾液；

S8、對(duì)經(jīng)洗滌過(guò)的濾液進(jìn)行萃取，離心得到細(xì)胞穿膜肽粗品；

以及S9、對(duì)所述細(xì)胞穿膜肽粗品進(jìn)行鑒定和純化。

3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述樹(shù)脂包括Fmoc-Wang樹(shù)脂。

4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在步驟S2中，所述縮合劑包括苯并三唑鎓鹽型縮合劑；在步驟S1中，所述第一溶劑包括：二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二氯甲烷及四氫呋喃中的一種或幾種；在步驟S5中，所述脫帽液包括：二甲基甲酰胺溶液，以及溶解于二甲基甲酰胺溶液中的6％W/V的哌嗪和0.1M HOBT；在步驟S7中，所述切割液包括：以重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，95％的TFA、2％的TIS以及3％的H₂O。

5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述苯并三唑鎓鹽型縮合劑包括O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸鹽中的一種或幾種。

6.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，每種氨基酸與所述樹(shù)脂的投料摩爾量比例為(1:1)-(10:1)；所述縮合劑與所述樹(shù)脂的投料摩爾量比例為(1:1)-(10:1)。

7.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S8中，所述萃取包括：在經(jīng)洗滌過(guò)的濾液中加入無(wú)水乙醚，放置1-4h；且所述無(wú)水乙醚與濾液的體積比為(5:1)-(60:1)。

8.一種如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞穿膜肽的應(yīng)用方法，其特征在于，所述細(xì)胞穿膜肽用于在C端或N端共價(jià)或非共價(jià)連接標(biāo)記物或載物分子，并攜帶所述標(biāo)記物或載物分子穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。

9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用方法，其特征在于，攜帶所述標(biāo)記物或載物分子穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程包括：所述細(xì)胞穿膜肽與質(zhì)粒DNA結(jié)合以用于介導(dǎo)質(zhì)粒DNA。

10.如權(quán)利要求9任一項(xiàng)所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述細(xì)胞穿膜肽與質(zhì)粒DNA結(jié)合以用于介導(dǎo)質(zhì)粒DNA的過(guò)程包括如下步驟：

S1、將質(zhì)粒DNA與所述細(xì)胞穿膜肽各自混合于磷酸鹽緩沖液中；

S2、調(diào)整所述質(zhì)粒DNA與所述細(xì)胞穿膜肽兩者間的N/P比為0-80；

S3、培養(yǎng)過(guò)夜的細(xì)胞，用無(wú)血清的培養(yǎng)基洗滌，將含有所述質(zhì)粒DNA和細(xì)胞穿膜肽的磷酸鹽緩沖液加入到培養(yǎng)基中；

以及S4、4-6h后去掉培養(yǎng)基，添加含有10-15％FCS的培養(yǎng)基，靜置1-4h。