[發(fā)明專利]高通量測(cè)定血清中25-羥基維生素D的定量檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810602140.4
• 申請(qǐng)日: 2018-06-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108732285B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高飛;海云;陳亮;欒羽;張志棟;黃新良;徐可豐;李冰;羅示齊;王萬(wàn)強(qiáng);黃曙;劉禮歡;周響響;應(yīng)海媚
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州度安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/06
• 分類號(hào): G01N30/06;G01N30/88
• 代理公司: 無(wú)錫市匯誠(chéng)永信專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32260
• 代理人: 張歡勇

1.一種高通量測(cè)定血清中25-羥基維生素D的定量檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1:待測(cè)樣本的前處理：取血清樣品加入含有25-羥基維生素D同位素的內(nèi)標(biāo)物，渦旋震蕩完成蛋白沉淀，加入特丁基甲醚渦旋震蕩萃取，并離心得到第一上清液，向下層溶液再加入特丁基甲醚渦旋震蕩萃取，并離心得到第二上清液，合并所述第一上清液和所述第二上清液得到上清液，氮?dú)獯蹈伤錾锨逡?，并加入?fù)溶液渦旋震蕩后離心得到待測(cè)樣本，其中所述渦旋震蕩時(shí)間均控制在3-5分鐘，在獲得所述上清液的時(shí)候以及添加所述復(fù)溶液后的離心條件為：4℃條件12000rpm下離心5分鐘，所述氮?dú)獯蹈傻臈l件為室溫下完成氮?dú)獾拇蹈?，所述?fù)溶液選擇為75-85%的甲醇溶液；

S2:超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜完成檢測(cè)所述待測(cè)樣本，獲得所述待測(cè)樣本的峰面積和對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積，

液相色譜的條件為：

流動(dòng)相A液:0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B液: 2 mM甲酸銨與0.1%甲酸甲醇溶液；流速：0.5mL/min，柱溫為40℃，進(jìn)樣20μL；

所用洗脫梯度：0-0.1 min, 85%；流動(dòng)相B液在0.1-0.5 min, B液升高到95%；0.5-1min, B液升至100%； 1-1.5 min, 維持 100%； B液； 1.51 min, B液降到85%，維持0.5 min到2 min；

串聯(lián)-質(zhì)譜條件為：

離子源：電噴霧離子源，正離子模式；噴霧毛細(xì)管電壓：1.0-2.5 KV；脫溶劑氣溫度：400-600℃；脫溶劑氣流速：800-1000 L/Hr；離子源溫度：130-150℃；脫溶劑氣壓力：8 bar；碰撞氣壓力：0.7 bar；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，在2分鐘內(nèi)分離25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3；

以及

S3:代入所述待測(cè)樣本的峰面積與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值得到回歸方程，得到所述待測(cè)樣本的含量，其中所述回歸方程反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積比值和標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度之間的關(guān)系。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量測(cè)定血清中25-羥基維生素D的定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟S1當(dāng)中所述25-羥基維生素D同位素的內(nèi)標(biāo)物中25-羥基維生素D同位素選擇為d³-25羥基維生素D2和/或d³-25羥基維生素D3。

3.根據(jù)權(quán)利要求1到2任一所述的高通量測(cè)定血清中25-羥基維生素D的定量檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

A1:制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液

以甲醇配制25-羥基維生素D的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，然后加入人造血清，制備不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，2-8 oC保存?zhèn)溆茫?/p>

A2:所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為步驟S1當(dāng)中的樣品，進(jìn)行步驟S1和步驟S2的操作；

A3：獲取不同標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積以及對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)峰面積，以所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為X軸，所述標(biāo)準(zhǔn)品峰面積和對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為Y軸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行回歸分析，經(jīng)過(guò)“1/X”權(quán)重因子得到所述回歸方程。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高通量測(cè)定血清中25-羥基維生素D的定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟A1當(dāng)中，所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度控制在1-100ng/ml。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高通量測(cè)定血清中25-羥基維生素D的定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液和所述人造血清的體積比為1:50。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高通量測(cè)定血清中25-羥基維生素D的定量檢測(cè)方法，其特征在于，以空白介質(zhì)進(jìn)行步驟A1-步驟A3,所述空白介質(zhì)為2%甲醇人造血清。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高通量測(cè)定血清中25-羥基維生素D的定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟S2當(dāng)中，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè)時(shí)間在2分鐘內(nèi)。