[發明專利]基于免疫磁珠和流式細胞儀的循環腫瘤細胞檢測方法

在審

• 申請號: 201810600371.1
• 申請日: 2018-06-12
• 公開（公告）號: CN108982839A
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發明（設計）人: 陳繼冰;王雪瑩
• 申請（專利權）人: 廣州四葉草健康科技有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N15/14;G01N33/574
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 張芬;劉婉

本發明提供了一種基于免疫磁珠和流式細胞儀的循環腫瘤細胞檢測方法，其包括以下步驟：對外周血進行穿刺抽血，然后將血液進行重懸血細胞，去掉大部分紅細胞，再加入CD326磁珠進行分離；經過第一次流式細胞儀分選，去掉大部分淋巴細胞，再進行第二次流式細胞儀分選，去掉全部淋巴細胞，最后對剩余細胞進行第三次流式細胞儀分選，即檢測出是否存在循環腫瘤細胞。本發明的方法簡單易操作，檢測靈敏度高。

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，具體涉及一種基于免疫磁珠和流式細胞儀的循環腫瘤細胞檢測方法。

背景技術

循環腫瘤細胞(Circulating tumor cell,CTC)是存在于外周血中的各類腫瘤細胞的統稱。大量研究表明，CTC以不同形態存在于外周血中，既有游離的單個CTC，也有聚集成團的細胞團(CTM，CirculatingTumorMicroemboli)。腫瘤細胞在進入外周血循環的過程中會發生上皮-間質轉變(EMT，EpithelialMesenchymalTransition)，故CTC存在不同類型，包括上皮細胞表型、間質細胞表型和上皮細胞與間質細胞混合表型。CTM和間質細胞表型CTC具有更強的轉移潛能。早期發現血液中的CTC，對于患者預后判斷、療效評價和個體化治療都有著重要的指導作用。CTC檢測通過捕捉檢測外周血中痕量存在的CTC，監測CTC類型和數量變化的趨勢，以便實時監測腫瘤動態、評估治療效果，實現實時個體治療。

目前，臨床上應用的獲得美國FDA和中國藥監局批準的唯一的檢測循環腫瘤細胞(Circulating tumor cell,CTC)的方法是強生公司的儀器(商品名CellSearch)，這是一種使用表皮細胞特異性蛋白作為腫瘤標志物，同時利用免疫磁珠的方法將循環腫瘤細胞富集并最后進行免疫熒光顯微觀察檢測的一種半自動的循環腫瘤細胞計數方法。這種方法存在檢測陽性符合率較低的問題。同時由于其系統較為昂貴、單個檢測樣本成本較高、耗時較長，應用較為困難。因此，臨床上迫切需要一種特異性靈敏度高、成本低且操作簡單的循環腫瘤細胞檢測技術。其他正在申請或已授權專利，還有使用先細胞分離再核酸雜交及熒光顯微鏡檢測的，也都嚴重依賴操作和耗費人工，比較麻煩。

發明內容

本發明的目的是針對以上要解決的技術問題，提供一種特異性靈敏度高、成本低且操作簡單的循環腫瘤細胞檢測方法。

為了實現以上發明目的，本發明提供了以下技術方案：

一種基于免疫磁珠和流式細胞儀的循環腫瘤細胞檢測方法，其包括以下步驟：

(1)對外周血進行穿刺抽血，然后將血液進行重懸血細胞，去掉大部分紅細胞，再加入CD326磁珠進行分離；

(2)經過第一次流式細胞儀分選，去掉大部分淋巴細胞，再進行第二次流式細胞儀分選，去掉全部淋巴細胞，最后對剩余細胞進行第三次流式細胞儀分選，即檢測出是否存在循環腫瘤細胞。

優選地，步驟(1)的具體操作如下：

1)用含有枸椽酸鈉的ACD管采外周血7.5ml；

2)將血液轉入15ml離心管中，加入約5ml HBSS，重懸血細胞后，緩慢加至含7.5ml淋巴細胞分離液的50ml離心管液面上，1500rpm室溫離心18min，吸出中間霧狀單個核細胞層；

3)離心期間配紅細胞裂解液工作液；

4)加入5ml HBSS，1500rpm離心5min；去上清，加入3ml所述紅細胞裂解液工作液重懸細胞，室溫避光10min，1500rpm離心5min，去上清；

5)加入5ml HBSS重懸細胞，1500rpm離心5min去上清，加入MACS buffer5ml重懸細胞，1500rpm離心5min，去上清；