[發(fā)明專利]基于免疫磁珠和流式細(xì)胞儀的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810600371.1
• 申請(qǐng)日: 2018-06-12
• 公開（公告）號(hào): CN108982839A
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳繼冰;王雪瑩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州四葉草健康科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/543
• 分類號(hào): G01N33/543;G01N15/14;G01N33/574
• 代理公司: 廣州新諾專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44100
• 代理人: 張芬;劉婉

1.一種基于免疫磁珠和流式細(xì)胞儀的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)對(duì)外周血進(jìn)行穿刺抽血，然后將血液進(jìn)行重懸血細(xì)胞，去掉大部分紅細(xì)胞，再加入CD326磁珠進(jìn)行分離；

(2)經(jīng)過第一次流式細(xì)胞儀分選，去掉大部分淋巴細(xì)胞，再進(jìn)行第二次流式細(xì)胞儀分選，去掉全部淋巴細(xì)胞，最后對(duì)剩余細(xì)胞進(jìn)行第三次流式細(xì)胞儀分選，即檢測出是否存在循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)的具體操作如下：

1)用含有枸椽酸鈉的ACD管采外周血7.5ml；

2)將血液轉(zhuǎn)入15ml離心管中，加入約5ml HBSS，重懸血細(xì)胞后，緩慢加至含7.5ml淋巴細(xì)胞分離液的50ml離心管液面上，1500rpm室溫離心18min，吸出中間霧狀單個(gè)核細(xì)胞層；

3)離心期間配紅細(xì)胞裂解液工作液；

4)加入5ml HBSS，1500rpm離心5min；去上清，加入3ml所述紅細(xì)胞裂解液工作液重懸細(xì)胞，室溫避光10min，1500rpm離心5min，去上清；

5)加入5ml HBSS重懸細(xì)胞，1500rpm離心5min去上清，加入MACS buffer5ml重懸細(xì)胞，1500rpm離心5min，去上清；

6)加入CD326磁珠(20ul/10⁷個(gè)細(xì)胞)，4℃遮光孵育30min，用MACS Buffer洗滌細(xì)胞，1500rpm離心5min，去上清；

7)取LS磁珠分離管安裝于磁板上，用3ml MACS buffer潤洗分離柱，用500μl MACSbuffer重懸細(xì)胞后加入分離柱，等液體全部流出；

8)用3ml MACS buffer涮洗管壁后加入分離柱；

9)加入5ml MACS buffer然后迅速取出分離柱放于流式管上，將分離柱的液體推入所述流式管中，1500rpm離心5min，去上清；

10)加入1ml HBSS后重懸細(xì)胞，1500rpm離心5min，去上清；

11)加入三種抗體CK、CD326和CD45，每種10ul，充分混勻，室溫避光孵育12min，再加入5ml PBS，1500rpm離心5min去上清，加入500μl PBS上流式細(xì)胞儀。